藜麦CqCIPK7基因的克隆与表达分析

时丕彪， 洪立洲， 王 军， 费月跃， 王伟义， 吕远大， 顾闽峰

(1.盐城市新洋农业试验站，江苏 盐城 224049； 2.江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所，江苏 南京 210014)

土壤盐碱化不利于作物生长，从而影响作物产量，严重限制农业的可持续发展[1-4]。过量的盐分会引起离子和渗透胁迫，严重危害植物的光合作用、生长发育、能量代谢和蛋白质合成[5-7]。植物主要通过感知和转导胁迫信号来响应盐胁迫。在长期的进化过程中，植物形成了多种复杂的机制来保护自己免受盐胁迫的危害，包括限制Na+吸收、增加Na+外排以及液泡内Na+的区隔化，还可以控制Na+从根部向植株地上部的运输[8-9]。研究者还发现，维持细胞质中K+/Na+的稳定比值对植物细胞功能的发挥非常重要[10]。

Ca2+作为第二信使，在多种信号转导途径中发挥着重要作用[11]。植物体内含有多种Ca2+调节蛋白，包括钙调蛋白、钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL)和钙依赖蛋白激酶(CDPK)。CBL是一种植物特异基因，编码一种类似于酵母和动物细胞蛋白磷酸酶的钙调蛋白B亚基的蛋白质[12]。CBL在拟南芥中被认为是盐胁迫反应的重要参与者[13]，它能与CIPK(CBL-interacting protein kinase)C末端保守的NAF/FISL结构域特异性结合[14]。CIPK是植物所特有的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与非生物胁迫相关[2]。CIPK蛋白通常含有一个激酶激活结构域、一个调节结构域以及连接二者的连接结构域[15]。随着生物信息学和比较基因组学的不断向前发展，越来越多物种的CIPK基因被挖掘出来。迄今，在拟南芥中已发现26个AtCIPK[16]，水稻中有31个OsCIPK[17]，玉米中有43个ZmCIPK[18]，高粱中有32个SbCIPK[19],甘蔗中有8个ScCBL[20]，油菜中有23个BnaCIPK[21]等。

CIPK在植物响应外部刺激的反应中起着极其重要的作用。SOS(Salt overly sensitive)通路是盐信号转导中最重要的通路之一[22]，比如AtCIPK24与AtCBL4的互作，直接作用于Na+/H+逆向转运蛋白AtSOS1 (AtNHX7)，能够增强拟南芥的耐盐能力[23]，AtCBL10-AtCIPK24复合物使地上部组织免遭盐害[24]。拟南芥atcipk21突变体表现出较弱的耐盐性[25]。小麦TaCIPK14和TaCIPK29分别增强了转基因烟草的耐盐性和耐寒性[26-27]。TaCIPK25过表达减弱了小麦的耐盐性[4]。将MdCIPK6L基因转入苹果和拟南芥中均能增强其对盐、旱和冷胁迫的抗性[28]。将玉米ZmCIPK16转入拟南芥sos2突变体能促进AtSOS1基因的表达，从而提高其耐盐性[29]。二穗短柄草BdCIPK31基因则通过ABA信号通路增强植株对干旱和盐胁迫的抗性[30]。

藜麦(ChenopodiumquinoaWilld.)是一种阔叶草本植物，不仅具有极其丰富的营养价值，还具有对各种环境条件适应性强的特点[31]。然而，藜麦作为一种耐盐作物，我们对其耐盐机理尚不清楚。藜麦参考基因组的公布[32]以及关于藜麦盐碱性转录组研究的完成都为挖掘藜麦耐盐基因及解析其耐盐机理提供了重要的参考价值，有望加快耐盐藜麦育种进程。本研究从藜麦中克隆CqCIPK7基因的cDNA全长序列，并对该基因及其编码蛋白质的结构特征进行分析，利用RT-qPCR(Real-time quantitative PCR)技术分析其在藜麦不同组织器官及盐胁迫下的表达模式，为进一步研究CqCIPK7的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

藜麦材料为本课题组保存的R-64。主要试剂为RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)、PrimeScript TM RT-PCR Kit反转录试剂盒(TaKaRa)、Trans2K DNA Marker (TransGen Biotech)、Gel Extraction Kit (OMEGA)、Fast Start Universal SYBR Green Master (Roche)。

1.2 材料处理

将藜麦种子用3% H2O2杀菌消毒后于发芽盒进行催芽，待种子萌发子叶平展时进行水培处理。六叶一心期挑选长势一致的幼苗用300 mmol/L NaCl溶液处理，在处理0 h、6 h、12 h和24 h后取藜麦的根部组织，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱用于RNA提取，每个处理设3次生物学重复，以处理0 h的样品作为对照。

1.3 藜麦总RNA提取及cDNA合成

用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，包括组织特异性材料的种子、根、茎、叶、花序、幼苗及经NaCl处理的幼苗的根。基因克隆和表达分析所用的cDNA模板均按照PrimeScript TM RT-PCR Kit试剂盒说明书合成。

1.4 CqCIPK7基因的克隆

根据藜麦转录组测序数据及UniGene功能注释结果获得CIPK7基因碱基序列，设计基因特异性引物CqCIPK7-cDNA-F和CqCIPK7-cDNA-R(表1)，以藜麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系总体积50 μl，含2×TaqMaster Mix 25 μl，cDNA模板1 μl，正反向引物各1 μl，ddH2O 22 μl。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经胶回收纯化后，连接到pMD18-T 载体上，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。菌液PCR验证为阳性单菌落的菌液送至测序公司进行测序。

1.5 CqCIPK7基因的生物信息学分析

运用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线分析CqCIPK7基因的开放阅读框架并翻译成氨基酸，利用ExPASy ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质相对分子质量和理论等电点等，利用NCBI CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白质保守结构域，用GORIV (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)预测蛋白质二级结构，用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)预测蛋白质三级结构，用ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)预测蛋白质的亲水性，用SignalP-5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行蛋白质信号肽分析，用PSORT (http://psort1.hgc.jp/form.html)进行亚细胞定位预测。使用ClustalX 2.0软件对CqCIPK7的氨基酸序列及NCBI上下载的其他物种同源CIPK7蛋白的氨基酸序列进行多重比对。使用MEGA 5.05软件，采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ) (bootstrap=1 000)构建系统进化树。

表1 CqCIPK7基因克隆与定量表达所用引物序列

1.6 CqCIPK7基因表达分析

根据CqCIPK7基因的碱基序列设计RT-qPCR引物CqCIPK7-Q-F和CqCIPK7-Q-R(表1)，CqEF1a为内参基因[33]，进行定量表达分析。PCR反应体系为20.0 μl：10.0 μl SYBR green supermix、2.5 μl cDNA、正反向引物各1.0 μl、5.5 μl ddH2O。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。采用2-△△Ct法[34]计算目的基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 CqCIPK7基因克隆与序列分析

利用特异性引物进行RT-PCR扩增，从藜麦叶片中克隆得到CqCIPK7基因1 407 bp的cDNA全长序列，GenBank登录号为XP_021744082.1。序列分析结果表明该基因包含4个外显子和3个内含子，不含有5′端或3′端非翻译区，含有一个1 407 bp的开放阅读框架，编码468个氨基酸。

2.2 CqCIPK7蛋白的生物信息学分析

2.2.1 CqCIPK7蛋白的理化性质分析 利用ExPASy软件分析CqCIPK7蛋白的氨基酸序列，结果显示该蛋白质分子式为C2 245H3 603N655O670S26，相对分子质量为5.13×104，理论等电点为9.33；在构成蛋白质的20种氨基酸中，丝氨酸含量最多(10.3%)，其次是甘氨酸(9.2%)和亮氨酸(8.8%)，半胱氨酸(1.9%)和色氨酸(1.3%)含量最少；脂肪族指数为80.66，不稳定系数为47.06。预测CqCIPK7蛋白为一种不稳定的碱性蛋白质。

2.2.2 CqCIPK7蛋白的保守结构域及亚细胞定位预测 结构域预测结果显示，该蛋白质在第28～290个氨基酸之间含有一个S_TKc保守结构域，为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区；在第341～364个氨基酸之间含有一个NAF保守结构域，为与CBLs互作的调控结构域。亚细胞定位预测结果表明，CqCIPK7蛋白可能定位于叶绿体基质、叶绿体类囊体膜、叶绿体类囊体空间和微体(过氧化物酶体)，概率分别为91.8%、70.4%、67.1%和30.0%。

2.2.3 CqCIPK7蛋白的二级结构和三级结构预测 二级结构预测结果显示，CqCIPK7蛋白主要由α螺旋、延伸链和无规则卷曲组成，其中无规则卷曲比例最大，为49.15%，其次是α螺旋占29.70%，延伸链比例最小，为21.15%。三级结构预测结果与二级结构预测结果基本一致，CqCIPK7蛋白的空间结构以无规则卷曲为主，含有少量α螺旋和延伸链。

2.2.4 CqCIPK7蛋白的亲水性分析 利用ProtScale在线分析CqCIPK7蛋白的亲水性，结果显示，在第226位具有最高分值，为3.111，疏水性最强；在第371位和372位具有最低分值，为-3.644，亲水性最强。该蛋白质的亲水性平均值为-0.315，表明CqCIPK7蛋白是一种亲水性蛋白质。同时，此蛋白质没有信号肽，属于非分泌蛋白质。

2.2.5 CqCIPK7蛋白的同源性及系统进化关系分析 在NCBI数据库通过BLASTP比对得到菠菜SoCIPK7 (Spinaciaoleracea, XP_021838560.1)、甜菜BvCIPK7 (Betavulgaris, XP_010669683.1)、苹果MdCIPK7(Malusdomestica, NP_001315663.1)、青蒿AaCIPK7 (Artemisiaannua, PWA86146.1)、棉花GhCIPK7 (Gossypiumhirsutum, XP_016729098.1)、拟南芥AtCIPK7 (Arabidopsisthaliana, NP_188940.1)、黄瓜CsaCIPK7 (Cucumissativus, KGN56923.1)、番茄SlCIPK7(Solanumlycopersicum, XP_004247630.1)、核桃JrCIPK7 (Juglansregia, XP_018818635.1)和榴莲DzCIPK7 (Duriozibethinus, XP_022761105.1)蛋白的氨基酸序列，并与藜麦CqCIPK7蛋白的氨基酸序列进行同源性比对，序列一致性分别为89.04%、82.57%、54.14%、54.25%、55.65%、51.78%、58.07%、55.62%、50.34%和55.00%，表现出不同的同源性。

系统进化树分析结果显示，藜麦CqCIPK7蛋白与同科植物菠菜SoCIPK7蛋白和甜菜BvCIPK7蛋白处于同一分支，同源性最高，亲缘关系最近。而CqCIPK7蛋白与其他植物CIPK7蛋白的进化距离较长，处于不同分支，遗传关系较远。

2.3 CqCIPK7基因组织特异性表达

RT-qPCR结果表明，CqCIPK7基因在藜麦种子、根、茎、叶、花序中均有表达，但具有明显的组织表达特异性。在根中表达量最高，且显著高于其他组织，其次是茎和花序，在叶和种子中表达量最低，分别约为根的0.5倍和0.4倍。

2.4 CqCIPK7基因在盐胁迫下的表达

盐胁迫对CqCIPK7基因表达产生一定的影响。试验结果显示，该基因的表达量随着盐胁迫时间的延长而逐渐增加，呈上调表达模式，处理6 h与对照之间表达量差异不显著，处理12 h和24 h的表达量均显著高于对照。说明CqCIPK7基因可能参与了盐胁迫响应过程。

3 讨 论

植物经过长期的进化历程，形成了一系列复杂且高度协调的信号途径，以应对不利的生长环境。钙信号参与多种植物信号转导途径，Ca2+在植物胁迫信号转导中的作用已被证实[35-38]。CBL-CIPK蛋白在Ca2+信号通路中起重要的调控作用，影响植物生长发育，并参与生物和非生物胁迫响应[1]。目前，已在拟南芥[39]、水稻[1]、玉米[18,31]、甘蔗[20]和油菜[40]等作物中对CBL和CIPK进行了鉴定和功能验证，但关于藜麦CBL和CIPK的研究至今还没有报道。本研究从藜麦中克隆到一个蛋白激酶基因，命名CqCIPK7。生物信息学分析结果表明，CqCIPK7蛋白属于亲水性不稳定碱性蛋白质，也是一种非分泌型蛋白质，相对分子质量5.13×104，理论等电点9.33；该蛋白质包含2个保守结构域，即N末端S_TKc激酶结构域和C末端NAF调控结构域，与前人在玉米[3]、二穗短柄草[30]、小麦[2]、茄子[41]等作物上的研究结果一致。CqCIPK7蛋白定位于叶绿体基质(概率91.8%)、叶绿体类囊体膜(70.4%)和叶绿体类囊体空间(67.1%)，而拟南芥AtCIPK1定位于细胞质、细胞膜和细胞核，这种差异可能与CIPK互作的CBL有关[42]。CqCIPK7蛋白与亲缘关系较近物种(如菠菜和甜菜)相应蛋白质的同源性在80%以上，而与亲缘关系较远物种相应蛋白质的同源性只有50%左右，说明不同物种间CIPK7蛋白的保守性一般。

CIPK基因的表达受植物发育时期和取样部位的不同而呈现不同的表达模式。油菜BnCIPK9在叶片中表达量最高，其次是茎，在角果皮、花和芽中表达量较低，在种子和根中几乎不表达[43]。拟南芥AtCIPK25在花中表达量最高，其次是根和茎，在叶片中表达量最低[44]。本研究结果表明藜麦CqCIPK7基因具有明显的组织表达特异性，在根中表达量最高，其次是茎和花序，在叶片和种子中表达量最低，推测该基因可能参与了藜麦根系的生长发育过程。

CIPK是植物非生物胁迫信号通路的重要组成部分，在响应非生物胁迫过程中发挥着重要的调控作用。将油菜BnCIPK6基因转入拟南芥增强了其耐盐性、耐低钾性及对ABA的敏感性[45]。SlCIPK24的过量表达增强了转基因番茄植株的耐盐性[46]。GhCIPK6的过表达显著提高了转基因拟南芥对盐、干旱和ABA胁迫的耐受性[47]。本研究结果表明，CqCIPK7受盐胁迫诱导后上调表达，其表达量在盐胁迫处理24 h内处于持续上升状态，并且在12 h时就已经显著高于对照。因此，推测CqCIPK7基因可能在藜麦耐盐胁迫过程中发挥着重要作用，但关于其功能验证及调控机理解析有待于进一步研究。