当归补血汤发酵产物对肉鸡免疫和抗氧化能力的影响

陈柯源， 宋向东， 程 峰， 张玉珺， 梁剑平， 郝宝成

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业农村部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室, 甘肃 兰州 730050； 2.甘肃农业大学，甘肃 兰州 730050)

随着畜禽养殖业规模的逐渐扩大，减抗(减少使用抗生素)、限抗(限制使用抗生素)的呼声日益高涨，中药饲料添加剂将是畜禽养殖业未来发展的选择。中药具有抗菌、增强免疫等多种生物活性，作为畜禽饲料添加剂已被广泛使用。当归补血汤(Danggui buxue tang，DBT)是一种传统的中药复方，由黄芪和当归组成，干质量比例为1∶5[1]，药理学研究结果表明，当归补血汤具有促进造血功能，刺激心血管循环，增加抗氧化及免疫活性的能力[1-8]。然而与中药相比，益生菌发酵中药具有毒副作用小、无抗药性、功能多样等优点，对动物机体有着更为显著的积极作用。多项研究结果表明，发酵中药可显著提高肉鸡日增质量，降低料肉比并对机体相关免疫指标起到明显的积极调控作用[9-11]。因此，研究和开发新型的绿色、无公害饲料添加剂已成当前的必然发展趋势。DBT作为经典中药复方，虽然在前期研究中发现其具有一定的促生长和提高免疫功能等作用，但效果并不显著，不能完全发挥DBT中药复方中有效成分的活性作用，且缺乏发酵DBT对肉鸡生长性能、免疫功能及抗氧化能力影响的系统研究。本研究拟采用枯草芽孢杆菌液体发酵DBT的方式制备DBT发酵产物，通过42 d的饲喂试验和相关指标测定，深入探讨并系统研究DBT发酵产物对肉鸡生产性能、免疫功能、抗氧化能力及十二指肠绒毛形态的影响，为DBT发酵产物用作新型饲料添加剂提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 菌种和试剂

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；新城疫(Lasota株)、传染性法氏囊疫苗购自哈药集团有限公司。黄芪、当归均购自甘肃复兴厚生物医药科技有限公司；鸡IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α等试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司(生产批号：SBE221910)；血清GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(生产批号：20190526)。

1.2 DBT药粉及发酵产物的制备

DBT药粉制备：将黄芪和当归洗净烘干后，按5∶1的质量比准确称取2种药材混合粉碎，并过60目筛。DBT发酵产物制备：无菌条件下，取-70 ℃下保存的枯草芽孢杆菌接种于血平板上，于37 ℃恒温箱中过夜培养。挑取单菌落于5 ml LB肉汤中，在37 ℃，160 r/min条件下培养15 h，以2%的体积分数接种于100 ml LB肉汤中，相同条件下传代培养得到种子液。以2.92%的体积分数将种子液接种于发酵培养基(0.95%无水葡萄糖，1.52%蛋白胨，0.30%酵母浸出粉，0.05%磷酸氢二钾，0.07%无水硫酸镁，0.02%碳酸钙，6.00% DBT药粉，100 ml去离子水，初始pH为7.2)中，在37 ℃，160 r/min条件下培养35.8 h，冷冻干燥后得到DBT发酵产物，发酵产物中枯草芽孢杆菌活菌数约为6.8×108CFU/g)。

1.3 试验动物与日粮

试验动物为210只1日龄体质量相近、健康的白羽肉鸡，随机分成5个处理，每个处理6个重复，每个重复7只鸡，A1为对照组，饲喂基础日粮，A2为DBT未发酵组，在基础日粮中添加1.0%的DBT药粉, A3、A4、A5为DBT发酵组，在日粮中分别添加0.5%、1.0%、2.0%的DBT发酵产物。试验期为42 d，1～21 d为试验前期，22～42 d为试验后期。

试验饲粮采用玉米-豆粕型基础饲粮，根据中国鸡饲养标准(2004)营养需要量进行饲粮配制，组成及营养水平见表 1。每个平养笼中饲养7只肉鸡，试验期间所有肉鸡饲养管理条件一致，环境温度从36 ℃逐渐降至22 ℃，自由采食和饮水，24 h光照，并按常规免疫程序进行疫苗接种。

表1 基础饲粮组成和营养水平(风干基础)

1.4 测定指标和方法

1.4.1 生长性能测定 分别在肉鸡21日龄和42日龄，禁食12 h，对每个重复的供试肉鸡称质量，并详细记录各个阶段的饲料消耗量，计算2个阶段肉鸡的平均日增质量(ADG)、平均日采食量(ADFI)以及料肉比(F/G)。

1.4.2 样品采集 分别在肉鸡21日龄和42日龄，禁食12 h，从每个重复的供试肉鸡中随机抽取2只，心脏采血10 ml，于4 ℃过夜，然后3 000 r/min离心10 min，分离血清于-80 ℃中保存，待测。

1.4.3 免疫器官脏器指数测定 分别在肉鸡21日龄和42日龄，心脏采血后放血处死，剖检，采集脾脏、法氏囊并称质量，脏器指数=脏器湿质量/体质量×100%

1.4.4 十二指肠绒毛形态观察 分别在肉鸡21日龄和42日龄，心脏采血后放血处死，剖检，在十二指肠的中间部位截取约2～3 cm，迅速浸入生理盐水中漂洗内容物，然后置于10%甲醛固定液中，将固定的标本经水洗、脱水、透明等步骤处理，再用石蜡包埋，冷却凝固后，制作厚度5 μm的切片，苏木精伊红染色，树脂封片。在石蜡切片中选出典型视野，采用生物显微镜及显微图像分析系统，测量肠绒毛高度(V)和隐窝深度(C)，并计算绒毛高度与隐窝深度比(V/C)。

1.4.5 新城疫抗体效价测定 用新城疫疫苗在7 d和21 d时对各组肉鸡进行点眼滴鼻免疫接种，采用半微量血凝抑制实验法测定HI抗体效价。

1.4.6 细胞因子测定 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清白细胞介素2 (IL-2)、白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素(INF-γ)含量，详细步骤参考试剂盒说明书。

1.4.7 抗氧化指标的测定 参照试剂盒说明书中的步骤进行血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量测定。

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS23. 0软件进行单因素(One-way ANOVA)方差分析，并采用LSD法进行组间差异显著性检验，以P<0.05作为差异显著水平，数据分析结果用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 DBT发酵产物对肉鸡生产性能的影响

由表2可知，在生长前期和整个试验期(1～21 d和1～42 d)中，各试验组肉鸡(A2～A5)的日增质量与对照组相比无显著差异，但A4和A5处理的日采食量与A2处理和对照组相比显著减少(P<0.05)，并且从整个试验期来看，DBT发酵组的料肉比显著低于A2处理和对照组(P<0.05)。而在试验后期(22～42 d)，各试验组(A2～A5)肉鸡日增质量均有显著提高(P<0.05)，其中，A4和A5处理最为显著(P<0.05)，但两组之间无显著差异，同时，试验组A2～A5的日采食量、料肉比与对照组相比均显著减少(P<0.05)，其中，A4和A5处理的料肉比与A2处理相比显著降低(P<0.05)，各试验组之间日采食量差异不显著。

表2 DBT发酵产物对肉鸡生长性能的影响

2.2 DBT发酵产物对肉鸡免疫器官指数的影响

由表3可知，在21 d时，A4处理与A2相比脾脏指数显著增加 (P<0.05)，其他各组之间差异不显著。A3～A5处理的法氏囊指数与对照组和A2处理相比具有显著差异(P<0.05)，A2处理与对照组差异不显著。

在42 d时，A3～A5处理的脾脏指数与对照组和A2处理相比具有显著差异(P<0.05)，A3～A5处理之间以及对照组与A2处理之间差异不显著(P>0.05)。A4和A5处理的法氏囊指数与其他3组相比均显著增加(P<0.05)，但A4处理与A5处理间无显著差异，A3处理和A2处理与对照组相比差异也不显著。

表3 DBT发酵产物对肉鸡免疫器官指数的影响

2.3 DBT发酵产物对肉鸡血清新城疫抗体效价的影响

由图1可知，在21 d和42 d，A4和A5处理的抗体效价均比其他3组有显著提高(P<0.05)，且A5处理高于A4。A2处理与A3处理与对照组相比较在21 d时均有一定水平提高(P<0.05)，但在42 d时差异不显著。

2.4 DBT发酵产物对肉鸡血清细胞因子的影响

由图2可知，在21 d和42 d时，与A2处理和对照组相比，DBT发酵组对于肉鸡血清中各个细胞因子的影响具有显著差异，其中， A4处理和A5处理影响较为突出(P<0.05)，但处理之间差异不显著。从整体上看，A4处理可显著影响血清中4种细胞因子含量，与对照组相比，在21 d时，A4和A5处理可使血清中IL-2(图2A)、IL-6(图2B)、TNF-α(图2C)、INF-γ(图2D)含量得到显著提高(P<0.05)。A2处理与对照组相比，IL-2含量显著增加(P<0.05)，其他3个指标均无显著差异。在42 d时，与对照组相比，A4处理血清中IL-2、IL-6含量显著降低(P<0.05)，而TNF-α、INF-γ含量则显著提高(P<0.05)。与对照组相比，A2处理在IL-2、IL-6含量上差异不显著，但在TNF-α、INF-γ含量上显著提高(P<0.05)。

A1、A2、A3、A4、A5见表2注；不同小写字母表示同一时间处理间差异显著(P<0.05)。图1 DBT发酵产物对肉鸡血清新城疫抗体效价的影响Fig.1 Effects of DBT fermentation products on ND-HI immune globulin of serum in broilers

A1、A2、A3、A4、A5见表2注；不同小写字母表示同一时间处理间差异显著(P<0.05)。图2 DBT发酵产物对肉鸡血清细胞因子的影响Fig.2 Effects of DBT fermentation products on cytokine of serum in broilers

2.5 DBT发酵产物对肉鸡血清抗氧化指标的影响

由图3可知，在21 d时，各组之间的超氧化物歧化酶及总抗氧化能力无显著性差异(P>0.05)，与对照组相比， A3、A4、A5处理谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均显著提高(P<0.05)，但各试验组之间差异不显著(P>0.05)。A4处理和A5处理与其他3组相比较，血清中丙二醛含量显著降低(P<0.05)，但A4、A5处理之间以及其他3组之间差异不显著。在42 d时，与A2处理和对照组相比，A4处理和A5处理肉鸡血清中各抗氧化指标差异显著(P<0.05)，但A4处理和A5处理之间差异不显著。

2.6 DBT发酵产物对肉鸡十二指肠绒毛形态的影响

由表4可知，在21 d，与对照组和A2处理相比较，A4处理和A5处理的肉鸡十二指肠绒毛高度有所增加，且隐窝深度相对降低，同时，绒毛高度与隐窝深度比值增加，此外，A4处理和A5处理与对照组相比，各指标也表现出相同的变化趋势，但各组之间无显著差异(P>0.05)。

在42 d，各试验组与对照组相比，绒毛高度都有所增加，且DBT发酵组高于DBT未发酵组，但各组之间差异不显著(P>0.05)。各试验组的隐窝深度与对照组相比都有所减少，A4处理的绒毛高度与隐窝深度比值与对照组和A2处理相比均显著提高 (P<0.05)。

A1、A2、A3、A4、A5见表2注；不同小写字母表示同一时间处理间差异显著(P<0.05)。图3 DBT发酵产物对肉鸡血清抗氧化能力的影响Fig.3 Effects of DBT fermentation products on serum antioxidant capacity of broilers

表4 DBT发酵产物对肉鸡十二指肠绒毛形态的影响

3 讨 论

本研究结果显示，日粮基础饲料中添加1.0%的DBT发酵产物(A4处理)可有助于提高肉鸡的日增质量，降低料肉比和日采食量，并显著改善动物的免疫功能和抗氧化能力，同时对十二指肠绒毛形态的完整性也起到了保护作用，且效果优于DBT未发酵组。

益生菌发酵中药技术极大促进了畜牧养殖业的健康发展。传统中药可显著提高肉鸡的生长性能[12]，而发酵中药使中药药效在动物体内得到了更好的发挥。相关研究报道显示，张晓静等通过在日粮中添加发酵黄芪-甘草水提物或黄芪发酵产物，可使肉鸡的日增质量和料肉比都分别显著升高和降低，且发酵中药的效果优于未发酵中药[13-14]。本研究结果表明，发酵DBT可显著增加肉鸡日增质量，减少日采食量并降低料肉比，同时DBT发酵组的作用效果要优于DBT未发酵组，这与上述研究报道一致。这可能是由于中药发酵后有效成分含量增加，从而药效增强。同时，本试验中所采用的枯草芽孢杆菌是农业农村部允许作为饲料添加剂的益生菌菌种之一，其广谱的抗菌活性以及平衡肠道菌群的作用，可显著提高动物的生产性能[15-16]。因此，DBT发酵产物对肉鸡的生长有显著的促进作用。

良好的免疫性能可平衡体内免疫相关活性物质的分泌，从而有效抵抗外界致病菌。IL-2和IL-6可分别通过细胞和体液免疫的调节来促进免疫球蛋白和抗体的产生[17-19]。IFN-γ可通过激活巨噬细胞达到促进对病原体的吞噬及杀伤的作用，同时还可诱导B细胞分化，促进抗体的产生。TNF-α可对相关细胞因子的分泌和单核巨噬细胞的活化起到调控作用，进而发挥抗病毒功效[20-21]。相关研究发现，肉鸡经饲喂中药发酵产物后，其脾脏、法氏囊指数、ND抗体效价以及血清中IgG和IL-2含量等免疫性能指标与未发酵组相比均有显著提高[22-23]。作为禽类最重要的免疫器官，脾脏和法氏囊对体内免疫活性物质的产生起着重要作用。本研究中，1.0% DBT发酵组与DBT未发酵组和对照组相比，ND抗体效价、各细胞因子水平及免疫器官指数在21 d时均显著增加。这可能与发酵产物中多糖含量的增加有关[24]，因为多糖具有抗肿瘤和刺激机体免疫等功能，使免疫指标水平得到显著提高，此外，IL-2和IL-6作为促炎因子，若长期在体内维持高水平表达，则会导致相关免疫细胞消耗大量物质和能量来平衡免疫应答[25]。本研究结果显示，在42 d时，DBT发酵组IL-2和IL-6的含量与其他组相比明显下降，而其他免疫指标则显著升高，说明1.0%的DBT发酵产物对肉鸡免疫性能具有良好的调节作用。

T-AOC、MDA、GSH-Px和SOD是评价机体抗氧化能力的重要指标[26]。T-AOC可反映机体对外界刺激的代偿能力和机体自由基代谢状态，MDA含量与细胞的氧化损伤程度有关[27-28]，GSH-Px和SOD可分别清除细胞代谢过程中产生的多余脂质过氧化物和超氧阴离子自由基，从而使细胞的形态结构保持正常水平。多项研究报道显示，发酵中药可对肉鸡抗氧化性能起到显著的改善作用，安胜英等[29]发现0.5%的中药复方发酵产物可使仔鸡血浆中GSH-Px的活性显著升高，同时明显降低了腿肌MDA含量。此外，给肉鸡饲喂1%的补中益气汤发酵制剂也可使其血清和肝脏中的T-SOD、GSH-Px活性等抗氧化指标得到显著改善，且功效优于未发酵组[30]。本研究结果显示，1.0%的DBT发酵产物可显著增加肉鸡血清中T-AOC能力和GSH-Px、SOD活性，同时使血清MDA含量明显下降，这与上述研究报道相一致。DBT中含有黄芪多糖、黄芪甲苷、阿魏酸等多种抗氧化成分，但在本试验中，DBT未发酵组对肉鸡的抗氧化指标并未起到十分显著的影响，推测可能由于本试验肉鸡品种对DBT药物敏感度较低所致，而DBT与枯草芽孢杆菌互作后，菌种的次级代谢产物可能与DBT的活性成分发生生物转化，合成新的抗氧化成分，从而对肉鸡的抗氧化性能的提高起到促进作用。

小肠绒毛形态间接反映了机体的生长发育状况，小肠绒毛高度和隐窝深度是评价动物消化吸收能力的重要指标，肠绒毛V/C值的高低与肠道净吸收量呈正相关[31-32]。前人研究报道指出，发酵芪楂口服液药渣使仔猪空肠、回肠绒毛高度和V/C值明显大于未发酵组，且绒毛宽度和隐窝深度小于未发酵组[33]，这说明发酵中药对小肠绒毛形态有良好的改善作用。此外，益生菌对于维持肠绒毛形态的完整性也有显著影响。有研究报道，枯草芽孢杆菌E-8可对大肠杆菌性腹泻有显著的治疗效果，并对肉鸡小肠绒毛形态起到良好的修复作用[34]。本试验采用枯草芽孢杆菌作为发酵菌种得到DBT发酵产物，与对照组和未发酵组相比，1.0% DBT发酵组可对小肠绒毛形态起到明显的改善作用，与上述研究报道相一致。

本研究中所用DBT经益生菌发酵后，DBT的有效活性成分种类及含量可能发生了某些改变，鉴于本次试验条件的局限性，仅对中药发酵产物的使用效果进行了研究，其作用机制尚需进一步研究。