二甲双胍通过mTOR 信号通路调节自噬减轻心肌梗死小鼠心肌损伤

徐志成，张久旭，张景智，孙腾飞，姜晓华，宋春霞

缺血性心脏病严重威胁着人类健康，其中冠状动脉阻塞导致的心肌梗死（myocardial infarction，MI）造成心肌细胞不可逆转坏死。 近年来，随着心血管介入技术的不断发展，大大增加了患者心梗后的存活率，而梗死后并发症导致的心功能下降却越来越普遍[1］。 如何进一步减轻心梗后心肌损伤、改善心功能成为心脏康复研究的重要领域。 既往研究表明心梗损伤机制与炎症刺激、氧化应激反应、凋亡等相关，最新研究表明心肌细胞的mTOR 信号通路介导的自噬在MI 后心室重构中发挥重要作用[2-6］。二甲双胍（metformin，Met）以往在临床上作为降糖药用于治疗2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM），近年来不断有文献报道其多样性应用研究，研究发现缺血性心脏病、糖尿病伴心力衰竭的患者使用二甲双胍安全有效[7-9］。 Met 通过信号分子的调控改善心肌功能、发挥心脏保护作用的研究也越来越多[10-12］。 本实验在小鼠MI 模型中发现，Met可以通过调节Akt／mTOR 信号通路来下调自噬水平减轻MI 后心肌损伤，从而为Met 用于MI 的临床应用积累更多的实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪器设备及材料 激光共聚焦显微镜、光学显微镜（奥林巴斯公司，日本），Western blot 电泳设备（Bio-Rad 公司，美国）。 C57BL／6 小鼠（健康，雄性，8 周龄）80 只，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司。 Met（Sigma 公司，美国），辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、mTOR、磷酸化mTOR （mammalian target of rapamycin， 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白） 、p62、LC3B 和Beclin1（Abcom 公司，美国），TUNEL 试剂盒购（Roche公司），肌酸激酶同工酶（creatine kinase， CKMB）试剂盒（R＆D 公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠MI 模型建立 异氟烷麻醉后，固定（仰卧位），连接心电图电极，记录心电图。 开胸暴露后，在小鼠心脏左心耳下方2 ～3 mm 处以6-0 号线结扎。 心电图II 导联ST 段抬高，结扎线下心肌缺血，模型建立成功。 假手术组仅开胸暴露。 所有小鼠随机分4 组，即假手术组（Sham 组）、单纯二甲双胍[300 mg／（kg·d）］处理组（Met 组）、MI 组和Met[300 mg／（kg·d）］干预MI 组（Met+MI 组）。 Met组和Met+MI 组小鼠手术后以灌胃方式给予Met[300 mg／（kg·d）］至术后1月，Sham 组和MI 组手术后不做任何干预，记录并计算各组小鼠死亡率，绘制生存曲线。

1.2.1 HE 染色 MI 建立1月后，迅速剪下心脏，冷PBS 缓冲液冲洗， 40 g／L 多聚甲醛固定72 h，石蜡包埋、切片及染色。

1.2.3 CKMB 检测 MI 建立后3 d，异氟烷麻醉，快速取小鼠颈动脉血至4 ml EP 管中，4℃低温静置8 h 后，3000 r／min 离心15 min，取上清即为血清。 严格按照CKMB 试剂盒说明书检测各组血清中CKMB的含量，结果以U／L 为单位表示。

1.2.4 TUNEL 染色 切取小鼠左室前壁组织，石蜡包埋、切片、脱蜡、复水，按TUNEL 试剂盒说明书检测，采集图像。 每张切片随机选取10个高倍镜视野计算细胞凋亡指数（apoptotic index， AI），凋亡细胞核为绿色，正常细胞核为蓝色。 AI ＝（凋亡细胞核数／总细胞核数）×100%。

1.2.5 LC3B 免疫荧光染色 切取小鼠左室前壁组织，石蜡包埋、切片、脱蜡、复水，用PBS 缓冲溶液洗5 次（3 min／次），Triton-X100（2 g／L）处理15 min，PBS 液冲洗5 次（3 min／次），山羊血清室温封闭1.5 h，PBS 液洗5 次（3 min／次），每个切片加LC3B 抗体（1 ∶100）50 μl，4 ℃孵育15 h， PBS 液洗5 次（3 min／次），暗室内每张切片加荧光二抗（1 ∶500） 50 μl，PBS 液洗5 次（3 min／次），避光条件下每张切片加DAPI 溶液50 μl，PBS 液洗5 次（ 3 min／次），用荧光防淬灭液封片，采集图像。

1.2.6 Western-blot 检测 切取小鼠左心室前壁组织50 mg，加入裂解液后低温研磨裂解30 min，离心20 min（4 ℃，12000 g），取上清，定量采用BCA 比色法。 分别配置80 ml／L、100 ml／L 和120 ml／L 的分离胶进行电泳，转膜至PVDF 膜上，牛奶常温封闭2 h，切下目的条带，放入相应的mTOR（1 ∶1000）、pmTOR（1 ∶1000）、Beclin1（1 ∶1000）、p62（1 ∶1000）和GAPDH（1 ∶5000）一抗中，4 ℃孵育过夜，再用TBST 溶液洗膜5 次（3 min／次），二抗常温孵育2 h，TBST 洗膜5 次（3 min／次），以GAPDH 为内参，发光液显色，采集图像。

1.3 统计学处理 GraphPad Prism 5.0 进行统计学分析并作图，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对小鼠生存分析曲线的影响 各组小鼠4 周后的生存率Kaplane-Meier 分析表明MI+Met 组比MI 组的死亡率明显降低（P＜0.05），主要死亡原因与心梗后心力衰竭有关，见图1。

图1 各组小鼠生存分析曲线

2.1 血清CKMB 含量的变化 Sham 组与Met 组血清CKMB 水平比较没有明显差异（P＞0.05）；与Sham 组相比，MI 组血清CKMB 水平明显升高（P＜0.05）；Met+MI 组血清中CKMB 水平比MI 组显著降低（P＜0.05）。 见图2。

图2 血清中CKMB 的含量

2.3 心肌组织TUNEL 染色 Sham 组与Met+Sham 组TUNEL 阳性细胞核染色较少且无差异（P＞0.05）；，MI 组比Sham 组TUNEL 阳性细胞核染色数量明显增多（P＜0.05）；与MI 组相比，Met+MI 组可明显减少TUNEL 阳性细胞核染色数量（P＜0.05）。 见图3。

图3 各组小鼠心肌组织TUNEL 染色和凋亡率

2.4 各组小鼠心肌自噬相关蛋白表达的变化Sham 组与Met 组自噬相关蛋白的含量无差异（P＞0.05）；MI 组比Sham 组p-mTOR 表达明显降低（P＜0.05），Beclin1、p62 含量显著增高（P＜0.05）；MI+Met 组比MI 组的p-mTOR 的含量显著升高（P＜0.05），Beclin1、p62 含量显著显著降低（P＜0.05）。见图4。

2.5 心肌LC3B 表达的免疫荧光染色 与Sham 组相比，Met 组LC3B 蛋白免疫荧光染色无统计学差异；与Sham 组相比，MI 组LC3B 蛋白免疫荧光染色数量明显增多（P＜0.05）；与MI 组相比， MI+Met 组LC3B 蛋白染色的数量显著减少（P＜0.05），见图5。

图4 各组自噬相关蛋白表达的变化

图4 小鼠心肌组织LC3B 免疫荧光染色

3 讨 论

急性MI 是常见的心血管急危重症，起病较为隐袭，且具有高死亡率，目前多数入院患者行经皮冠状动脉支架植入术（percutaneous coronary stent implantatio，PCI）后，症状能够明显缓解，术后心功能明显改善。 然而，MI 后的心肌损伤造成心功能下降，限制PCI 术后的效果[13］。 本研究建立小鼠MI 模型，探究MI 损伤相关指标和自噬相关指标变化，结果提示，MI 组心肌损伤加重、mTOR 的磷酸化表达被明显抑制，并伴有自噬增强。 给予Met 处理后，心肌损伤明显减轻、mTOR 的磷酸化表达增强，且伴有自噬降低。 上述结果提示，MI 损伤中，由mTOR 信号通路介导的自噬发挥重要作用。 本实验中，Met通过激活mTOR 信号通路、降低自噬，从而减轻MI造成的心肌损伤。

正常生理状态下，自噬的作用是清除受损细胞器、错误折叠的蛋白质、维持细胞稳态，广泛存在于细胞内[14］。 mTOR 作为PI3K 相关激酶家族成员及PI3K／Akt 信号通路下游分子，参与多种生物学过程，是自噬的调控中的关键分子，且与自噬过程呈负相关，mTOR 根据与其结合的蛋白质复合体的不同主要分为mTORC1 与mTORC2， 前者主要调节细胞能量代谢及蛋白合成。 本实验结果提示，在小鼠MI模型中，p-mTOR 表达降低，自噬相关蛋白Beclin1和LC3B 表达增加，p62 表达降低；而mTOR 被激活即p-mTOR 表达增高时，自噬相关蛋白Beclin1 和LC3B 表达减少，p62 表达增加，提示mTOR 信号通路介导自噬与小鼠MI 模型心肌损伤密切相关。

Met 是治疗T2DM 的重要降糖药物，以往专家共识中明确指出：可以将Met 列入T2DM 患者的第一步治疗中，即在单纯饮食控制和体育锻炼的同时接受Met 治疗[1］。 近年来，关于Met 的研究不断拓展到其他领域，研究发现能够抑制T2DM 患者消化系统及泌尿系统肿瘤的进程并改善预后，同时对于肿瘤治疗，还可以增强化疗疗效，但其具体作用机制尚未完全阐明。 Met 可以有效降低糖尿病相关心脏疾病风险，其心血管保护机制降糖、代谢改变以及细胞功能改善等相关[15-18］。 本实验发现Met 在减轻心血管损伤中发挥保护作用，其机制可能与自噬过程密切相关。 Met 可明显改善MI 后心肌纤维化程度及心肌细胞凋亡，减少血清中梗死标志物CKMB的含量，结果证实了Met 减轻MI 损伤的作用；同时，笔者还发现，Met 组自噬相关蛋白的表达与Sham 组均无明显变化；与Sham 组相比，MI 组p-mTOR 表达明显降低，LC3B 和Beclin1 的表达显著升高，p62表达降低；MI+Met 组p-mTOR 的表达比MI 组明显增高，自噬相关蛋白LC3B、Beclin1 的表达显著降低，p62 表达升高，表明Met 可以激活mTOR 信号降低自噬改善MI 损伤。 初步认为MI 心肌缺血抑制mTOR 信号通路的激活；Met 通过激活mTOR 信号通路下调自噬水平减轻MI 损伤。

根据以上实验研究结果，本研究已经证实Met通过激活mTOR 信号通路下调自噬减轻MI 损伤，为Met 在MI 中发挥保护作用提供了新的实验依据。然而，Met 激活mTOR 信号通路向下调MI 自噬具体机制仍有待进一步研究证实。