动脉粥样硬化患者CD4+CD25+调节性T 细胞上Kv1.3 通道的活性变化

邵劲松，胡 锴，王红瑞，王立伟，徐 博

1 材料与方法

1.1 病例筛选条件及分组

1.1.1 实验组及给药组病例入选标准 确定性冠心病包括心肌梗死史、稳定型心绞痛。

1.1.2 实验组及给药组病例排除标准 ①急、慢性感染，炎症性疾病；②自身免疫性疾病；③近期不稳定型心绞痛及急性心肌梗死（3个月内）；④风湿性疾病近期（3个月内）有风湿活动；⑤糖尿病、甲状腺功能亢进或其它内分泌疾病；⑥近期使用影响免疫反应药物（如皮质类固醇）；⑦严重肝、肾功能不全；⑧肿瘤；⑨妊娠。

1.1.3 分组及两组病例组成 按照是否诊断为ACVD 患者分为ACVD 组（n ＝70）和正常志愿者的Control 组（n ＝20）。 ACVD 组男性38例，女性32例，年龄46～79（68.12± 12.11）岁；Control 组男女各10例，年龄45 ～69（50.02±16.21）岁。 两组患者基线一致（P＞0.05）。

1.2 主要仪器及试剂 CT15RE 型低温高速离心机（Hitachi，日本），Midi 型磁力分选器（MACS，德国），25LS 型分选柱（MACS，德国），0.5 ～10、20 ～200和100～1000 μl 型移液枪（EPPendorf，德国），CD4+CD25+T cell solation kit，人 淋 巴 细 胞 分 离 液（LTS1077，Sigma），胎牛血清、RPMI1640 培养基（Hyclone），SYBR 试剂盒（Life），KCNN1.3 小鼠抗人，IRDye®800CW Goat anti-mouse（LI-COR）等。

1.3 免疫磁珠分离CD4+CD25+Tregs 收集ACVD组及Control 组的外周血5 ～10 ml，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）按照1 ∶1 的比例稀释，将稀释液缓缓的平铺于1077 分离液（SIGMA）上，离心，吸取中间云状细胞团并充分冲洗。 使用试剂盒双阴性分选获得CD4+CD25+Tregs。

1.4 CD4+CD25+Tregs 的分组与培养 用完全培养基[10%胎牛血清（10 μl／ml）， rmIL-2（2.5×106IU／ml），TGF-β1（2 μg／ml）及1 %双抗］混悬上述细胞，并均匀的种在3个10 cm 的培养皿（用含10 μg／ml Anti-CD3，10 μg／ml HSP60 包皿）中，将Control 组、ACVD 组和ACVD+EPL 组的CD4+CD25+Tregs 三组细胞培养48 h，待测。

1.5 流式细胞术验证CD4+CD25+Tregs 离心收集不同组的CD4+CD25+Tregs，RPMI-1640（含胎牛血清，细胞刺激剂、离子霉素、高尔基阻断剂）混悬细胞；留取下层细胞，浓度调整到1×106／ml；饥饿处理；分别加FITC Mouse Anti -Human CD3、APC Mouse Aniti-Human CD4、PE-CyTM7 Mouse Anti-Human CD25、PE Mouse Anti-Human CD127 各10 μl，加细胞表面抗原染色法标记，流式细胞仪检测，通过CellQuest 软件对所有染色的细胞进行数据分析，并记录阳性细胞的百分比。

1.6 RT-qPCR 检测CD4+CD25+Tregs 上Kv1.3、KCa3.1、激活钙释放Ca2+（CRAC）通道mRNA 表达收集各组CD4+CD25+Tregs，107／ml 细胞trizol 法提取细胞总RNA， 检测总RNA 的浓度及纯度。 逆转录，于PCR 扩增仪上进行Cycle2：（1）65℃5 min；25℃5 min；42℃60 min；70℃5 min；Cycle3（1）4℃，∞。 PCR 扩增，于冰上配扩增体系（H2O，6.4 μl，SYBR 10 μl，Primer 0.8 μl）加样品1.8 μl。 设定扩增程序Cycle1（1）50℃2 min；Cycle2（1）95℃2 min；Cycle3（40）95℃15 s，60℃15 s；Cycle4（1）60℃15 s；Cycle5（1）95℃15 s。 基因序列如表1 所示。

1.7 ICW 检测CD4+CD25+Tregs 蛋白的表达 收集各组CD4+CD25+Tregs 用上述1640 培养基混悬，分别布于U 型黑壁96 孔板中，37 ℃，5%的培养箱放置10 min；待细胞静置于底部后固定，于室温30 r／min摇床30 min；去上清，重新加入封闭液，轻摇；孵育一抗（KCNN1.3 小鼠抗人，ab105522）于4 ℃轻摇过夜；孵育二抗，避光轻摇1 h，于Odyssey 双红外激光检测仪上进行检测，中等扫描质量，调整分辨率、焦距及亮度，分别为169 μm、3.0 mm、5。

表1 基因序列

1.8 数据统计分析 本实验使用SPSS 22.0 软件对数据进行分析，使用单因素方差分析，进行t检验，P＜0.05 认为有显著性差异，具有统计学意义。

2 结 果

2.1 流式检测CD4+CD25+Tregs 的纯度 三组CD4+CD25+Tregs 的纯度均超过80 %故具有研究代表性，且三组不具有统计学差异。 流式结果见图1。

图1 流式检测CD4+CD25+Tregs 的纯度（n＝20）

2.2 CCK-8 法检测EPL 的最佳浓度 CD4+CD25+Tregs 给药孵育48 h 后给予CCK-8 试剂孵育（37℃，5%CO2）4 h 于紫外分光光度计上检测，得到下图的曲线，如图2 所示，0、0.3、1、3、10、30、100 μmol 的EPL 对CD4+CD25+Tregs CCK-8 染色的OD 值抑制率曲线，n ＝1，2，3……30 μmol 的EPL 大约抑制CD4+CD25+Tregs 增殖达53.26%，故30 μmol EPL 为最佳浓度。

2.3 RT-qPCR 检测各组CD4+CD25+Tregs Kv1.3、KCa3.1 和CRAC 通道的mRNA 表达 ACVD 组的Kv1.3、KCa3.1、CRAC 通道的mRNA 表达是Control组3.35、2.18、2.22 倍（P＜0.01）， ACVD+EPL 组是ACVD 组的三组离子通道的mRNA 表达62.09%、61.01%、76.68%（P＜0.01）。 将Control 组结果标化，ACVD 组与Control 组比较主要观察AS 性心血管疾病患者的CD4+CD25+Tregs 上Kv1.3、KCa3.1、CRAC 通道mRNA 表达，以及EPL 培养后各基因的相对表达。 见图3。

图2 不同浓度EPL 对CD4+CD25+ Tregs 增殖的抑制率

图3 CD4+CD25+Tregs 上相关离子通道的mRNA 表达

2.4 In-cell western blotting 检测CD4+CD25+Tregs Kv1.3 通道蛋白的表达 ACVD 者的CD4+CD25+Tregs Kv1.3 通道蛋白的表达是正常人CD4+CD25+Tregs Kv1.3 通道蛋白的表达的1.83 倍（P＜0.01）。ACVD 外周血中的CD4+CD25+Tregs 给予EPL 后，Kv1.3 通道蛋白的表达下降了26.19%（P＜0.01）。见图4 。

图4 CD4+CD25+Tregs Kv1.3 通道蛋白的表达

3 讨 论

AS 是由脂质代谢障碍引起的慢性炎症性疾病，动脉管壁失去弹性形成斑块或破裂，心功能降低，即为ACVD[8］。 有研究发现，粥样斑块的形成与病理状态下的免疫细胞激活和动脉管壁释放的炎性因子相互作用的结果[9］。 ACVD 是2013年提出的一个新概念，其中危害人类最严重的是各种常见的ACVD[10］。在炎症反应中，免疫系统肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system， RAAS）过度激活是也是导致AS 的重要原因，故血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitors， ACEI）类及β-受体阻滞剂被经典用于预防和逆转ACVD，大量研究表明ALD 通过其RAAS 信号转导通路在AS 引起的心功能衰弱的发生发展中起关键作用[11］。 ACEI 类及β-受体阻滞剂可减少ALD 在AS 时的释放，EPL 是第二代ALD 受体拮抗剂，具有选择性高，毒副作用小的优势。

ACVD 炎症学说被广泛的认可，在炎症反应中，免疫细胞被激活，产生的炎性介质进一步促进了AS的发展和恶化[12］。 T 淋巴细胞作用下的细胞免疫被激活，其调控模式为： 活化后的T 淋巴细胞，CRAC通道打开，Ca2+内流显著增加导致钙依赖性的蛋白激酶通路进行各种细胞因子合成[13］。 钙离子激活，使T 细胞处于能被活化的状态[14］。 选择性抑制Kv1.3 通道会抑制Tregs 的活化及其对相关细胞因子的分泌[15］。 由于Kv1.3 通道是T 淋巴细胞上的主要作用通道，因此Kv1.3 通道是免疫炎症疾病发生和发展的关键离子通道[16］。

ACVD 外周血中的CD4+CD25+Tregs 的Kv1.3、KCa3.1 及CRAC 通道的mRNA 的表达均较正常组显著增加，给予30 μmol EPL 后，其表达均被显著抑制，其中Kv1.3 通道抑制最为明显，并且在对Kv1.3 通道蛋白质进行的检测结果中发现ACVD 组的Kv1.3 蛋白质的表达显著增加，EPL 可显著抑制其表达（P＜0.01）。

综上所述，Kv1.3 等通道可调控ACVD 外周血CD4+CD25+Tregs 的活化，而ALD 受体拮抗剂EPL对ACVD 外周血CD4+CD25+Tregs 上的Kv1.3 通道具有显著的抑制作用，这一现象对揭示Kv1.3 通道与ALD 受体的关系具有重要意义。 Kv1.3 通道对ALD 抑制作用的具体机制仍需进一步深入研究，这对临床ACVD 的治疗提供了新的研究思路和治疗方向，T 淋巴细胞膜上的Kv1.3 通道在炎症疾病的治疗和靶向地位作用值得深入探究。