无核白葡萄酒澄清剂的筛选与优化

陈 雅，雷 静，廉苇佳，韩 琛，吴 斌,任红松

(新疆农业科学院吐鲁番农业科学研究所，新疆吐鲁番 838000)

0 引 言

【研究意义】无核白葡萄皮薄肉脆，汁多味甜，鲜果含糖量达24%以上[1]。2017年吐鲁番葡萄种植面积达到3.68×104hm2，年产量达99.5×104t[2]，其中无核白葡萄就占全吐鲁番葡萄种植面积的90%以上[3]。据“1/3酿酒、1/3制干、1/3鲜售”发展吐鲁番葡萄酒产业，延伸葡萄产业链来提高葡萄产品附加值[4]。无核白葡萄酒陈酿后，经过过滤已经呈现出较好的澄清度，但无核白葡萄酒中的不稳定物质(蛋白质、纤维素、酚类物质等)在后期贮藏过程中会随着时间和温度的变化，产生浑浊或者沉淀，影响酒的外观和品质[5]。酿造过程中采取澄清处理，去除无核白葡萄酒中的蛋白质、果胶质、酚类等物质，对保持无核白葡萄酒的澄清度和稳定性有重要意义。【前人研究进展】张宁波等[6]采用的皂土、明胶和海藻酸钠对赤霞珠葡萄酒进行澄清处理，研究不同澄清剂和澄清温度对赤霞珠葡萄酒的澄清效果，得到在10℃条件下用复合澄清剂(明胶∶皂土= 1∶1)对赤霞珠葡萄酒处理5～7 d可获得良好的澄清效果。康超等[7]使用不同澄清剂对山葡萄酒澄清工艺进行研究，采用单因素试验、理化性质及感官评定分析得出在15℃条件下，复合澄清剂A(壳聚糖0.09%+果胶酶0.08%)澄清效果最好，酒体透光率达到76.2%。这是因为壳聚糖有很强的黏性，带正电的壳聚糖溶液吸附无核白葡萄酒中带负电的物质，当其过量时自身形成一个稳定的絮凝体系，使无核白葡萄酒澄清度降低，不利于澄清[8]。【本研究切入点】目前国内外针对无核白葡萄酒澄清处理的研究尚未见报道。葡萄酒是复杂的胶体溶液，除含有酒精外，还含有甘油、芳香物质、色素、氨基酸、矿物质和人体必需的维生素等物质[9]，不同的葡萄酒原料，含有的成分以及含量也有所不同，对无核白葡萄酒的澄清处理的研究不可以简单套用葡萄酒及果酒的澄清工艺[10-14]。研究澄清剂对无核白葡萄酒的澄清效果，筛选与优化无核白葡萄酒澄清剂。【拟解决的关键问题】选取明胶、壳聚糖、皂土进行单因素试验以及响应面法优化试验，研究5种单一澄清剂(果胶酶、明胶、壳聚糖、皂土、植酸)对无核白葡萄酒澄清效果的影响，确定最适合无核白葡萄酒的复合澄清剂，为无核白葡萄酒的澄清剂的合理选择和使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 无核白葡萄酒

无核白葡萄酒为新疆农科院吐鲁番农业科学研究所自酿。

1.1.2 试剂

壳聚糖，成都市科龙化工试剂厂；皂土，上海试四赫维化工有限公司；果胶酶，上海蓝季科技发展有限公司；明胶，天津市盛奥化学试剂有限公司；植酸，成都市科龙化工试剂厂。

1.1.3 仪器

FA/JA 系列电子天平，上海上平仪器有限公司；UV754N型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Sigma 3K15离心机，北京五洲东方科技发展有限公司；DZKW电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂。

1.1.4 澄清剂配制[15-16]

根据无核白葡萄酒的特性及澄清剂的不同作用机理[17-19]，选取壳聚糖、皂土、明胶、果胶酶、植酸5种单一澄清剂对无核白葡萄酒澄清度及颜色的影响。

(1)1%壳聚糖溶液

将1 g柠檬酸于50 mL烧杯中，加入蒸馏水溶解，再加入1g壳聚糖，加热煮沸至完全溶解，冷却后定容至100 mL备用。

(2)1%皂土溶液

将1 g皂土于蒸馏水中浸泡24 h，直至完全膨胀后，配成均匀的悬浮液备用。

(3)1%明胶溶液

将1 g明胶加入50 mL蒸馏水中，浸泡24 h之后，40℃水浴加热溶解，冷却后定容至100 mL容量瓶中备用。

(4)1%果胶酶溶液

将1 g果胶酶用40～50℃的蒸馏水溶解后，再加入40～50℃的蒸馏水稀释至100 mL，配制成1%的溶液果胶酶，放置1～2 h后备用。

1.2 方 法

取20 mL无核白葡萄酒于25 mL比色管中，分别加入不同浓度的壳聚糖溶液、皂土溶液、明胶溶液、果胶酶溶液、植酸溶液，在常温下，静置24 h后，离心取上清液，于680 nm波长处测定其透光率(T%)。

1.2.1 单因素试验

(1)壳聚糖添加量对无核白葡萄酒澄清效果的影响。取20 mL无核白葡萄酒于25 mL比色管中，加入0.15 g/L的皂土溶液、0.12 g/L的明胶溶液，分别加入0.04、0.06、0.08、0.10和0.12 g/L壳聚糖溶液，在常温下静置24 h后，离心取上清液，于680 nm波长处测定其透光率(T%)。

(2)皂土添加量对无核白葡萄酒澄清效果的影响。取20 mL无核白葡萄酒于25 mL比色管中，加入0.08 g/L的壳聚糖溶液、0.12 g/L的明胶溶液，分别加入0.14、0.16、0.18、0.20和0.22 g/L的皂土溶液，在常温下静置24 h后，离心取上清液，于680 nm波长处测定其透光率(T%)。

(3)明胶添加量对无核白葡萄酒澄清效果的影响。取20 mL无核白葡萄酒于25 mL比色管中，加入0.08 g/L的壳聚糖溶液、0.16 g/L的皂土溶液，分别加入0.09、0.11、0.13、0.15和0.17 g/L的明胶溶液，在常温下静置24 h后，离心取上清液，于680 nm波长处测定其透光率(T%)。

1.2.2 响应面试验

从响应面图形上能形象地看出在反应过程中参数之间的相互作用及相互关系，曲面越陡，该因素对响应值的影响越大[20]。根据单因素试验结果，以壳聚糖添加量(A)、皂土添加量(B)、明胶添加量(C)3个因素作为变量因素，以透光率 (T%)作为响应值，采用Box-Behnken原理设计试验，试验因素与水平设计。表1，表2

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design matrix and results

1.3 数据处理

多元回归拟合后，得到透光率(Y)与壳聚糖添加量(A)、明胶添加量(B)、皂土添加量(C)的回归方程：

Y=98.26+0.56A-0.043B-0.21C+0.20AB+0.33AC-0.53BC-0.37A2-0.71B2-0.53C2

2 结果与分析

2.1 不同澄清剂对无核白葡萄酒澄清效果影响

研究表明,5种单一澄清剂的澄清效果为壳聚糖>明胶>皂土>果胶酶>植酸，果胶酶和植酸的澄清效果均不理想，果胶酶添加量在0.04 g/L时，澄清度达到96.27%；植酸添加量在0.11 g/L时，澄清度达96.07%。虽然已达到澄清，但相比于明胶、皂土、壳聚糖的澄清效果不显著，明胶、皂土、壳聚糖能显著提高无核白葡萄酒的透光率，澄清度都能达到比较理想的程度。这3种澄清剂均有一定的缺陷。其中，壳聚糖价格比较高，若用于规模化生产成本较高；皂土、明胶虽然价格便宜，但易导致无核白葡萄酒颜色过浅，使产品失去原有的禾杆黄色；将这3种澄清剂进行复合试验，取长补短，以获得澄清效果好、用量少、成本低的复合澄清剂。图1

图1 不同澄清剂下无核白葡萄酒澄清度Fig.1 Effect of different clarifying agents on clarification of thompson seedless wine

2.2 单因素试验

2.2.1 壳聚糖添加量对无核白葡萄酒澄清效果的影响

研究表明,无核白葡萄酒中加入壳聚糖溶液，会产生大量的絮状物沉淀且比较松散。随着壳聚糖溶液添加量的增加，无核白葡萄酒的澄清度逐渐增高，壳聚糖添加量为0.08 g/L时，透光率最大，达到97.95%；超过0.08 g/L，透光率呈现下降趋势。图2

图2 不同壳聚糖添加量下无核白葡萄酒澄清效果Fig.2 Effect of chitosan additions amount on clarifying effect of thompson seedless wine

2.2.2 皂土添加量对无核白葡萄酒澄清效果的影响

研究表明,加入皂土使无核白葡萄酒的透光率明显增高，皂土所带负电荷与酒中带正电荷的蛋白质等浑浊物相互吸引，当皂土加入量为0.16 g/L时，透光率达98.02%，但当皂土添加量超过0.16 g/L时，酒中带正电荷的蛋白质等浑浊物已被全部吸附，过量的皂土就会形成絮凝物，使无核白葡萄酒透光率降低。图3

图3 不同皂土添加量下无核白葡萄酒澄清效果Fig.3 Effect of bentonite additions amount on clarifying effect of thompson wine

2.2.3 明胶添加量对无核白葡萄酒澄清效果的影响

研究表明,无核白葡萄酒的澄清度随着明胶添加量的增加而逐渐上升，当明胶添加量为0.11 g/L时，酒体的澄清度超过98%，当明胶添加量超过0.11 g/L时，透光率逐渐下降，当明胶添加量达0.13 g/L时，透光率趋于平衡。图4

图4 不同明胶添加量对无核白葡萄酒澄清效果Fig.4 Effect of gelatin additions amount on clarifying effect of thompson seedless wine

2.3 建立模型方程与显著性

研究表明,模型P值为0.000 9，极显著(P﹤0.05)，试验方法可靠。失拟项P值为0.551 0>0.05，表现为不显著，回归方程拟合度和可信度均较好，试验误差小。因素A的P值<0.05，A壳聚糖添加量对无核白葡萄酒透光率的影响显著。A2、B2、C2的P值均小于0.05，A2、B2、C2对无核白葡萄酒透光率均有显著影响。而因素B、C的P值>0.05，因素B皂土添加量、C明胶添加量对透光率的影响不显著。交互项AB的P值为0.155 5大于0.05，AB对无核白葡萄酒透光率没有显著影响。交互项AC、BC的P值均小于0.05，AC、BC对无核白葡萄酒透光率有显著影响。复相关系数R2=0.950 0，无核白葡萄酒澄清度的验证值与模拟预测值之间的拟合度较好，反映了壳聚糖添加量、皂土添加量、明胶添加量与无核白葡萄酒澄清度之间的关系。表3

表3 回归模型方差Table 3 Analysis of variance for the fieerd regression model

2.4 响应面

研究表明,壳聚糖添加量增加有助于无核白葡萄酒的澄清，表现为曲线较陡，且随着壳聚糖添加量的增加无核白葡萄酒透光率也升高，但当达到一定澄清时间仍继续澄清时，则无核白葡萄酒透光率反而会下降，说明过多或过少的壳聚糖添加量均不适合无核白葡萄酒的澄清。皂土添加量与明胶添加量对无核白葡萄酒澄清度的交互效应显著，随着添加量的不断增加，无核白葡萄酒透光率逐渐增高，当2个因素增加到一定程度，无核白葡萄酒透光率又逐渐减小，过高或过低的添加量都会影响无核白葡萄酒透光率的高低。图5

2.5 验证试验

根据所建立的数学模型，得到无核白葡萄酒的最佳澄清剂为壳聚糖添加量0.09 g/L，皂土添加量0.16 g/L，明胶添加量0.11 g/L，在此条件下无核白葡萄酒透光率为98.473 1%。在此条件下进行3次平行试验，无核白葡萄酒实际透光率为98.45%，与理论值预测值基本吻合。根据该模型得到的最优酶解条件是可行的。图5

图5 各因素交互作用对无核白葡萄酒澄清度影响的等高线和响应曲面Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of chitosan addition amount,gelatin addition amount and bentonite addition amount on clarification of thompson seedless wine

3 讨 论

葡萄酒生产过程中，澄清剂的选择、澄清剂的添加量以及不同的澄清方法对葡萄酒会产生不同的澄清效果，品质也会得到不同程度的改善[21]。研究主要针对澄清剂的选择做了系统的分析，评价使用单一澄清剂的缺陷以及使用复合澄清剂的优势，3种澄清壳聚糖、皂土、明胶复合的澄清效果较好。

通过试验选择了壳聚糖、皂土、明胶作为无核白葡萄的澄清剂。一是壳聚糖属于多糖类物质，加入无核白葡萄酒中，带正电荷的壳聚糖吸引带负电荷的果胶、纤维素、酚类等微粒物质，结合成絮凝物沉淀，分离后得到澄清的无核白葡萄酒，且对酒的色度、成分与口感影响不大[22]。二是皂土吸水膨胀后形成胶体悬浮液，加入无核白葡萄酒中产生白色絮状沉淀，因为皂土是一种带负电荷的粘土，主要吸附酒中带正电荷的分子，如蛋白质，也能吸附酚类物质与蛋白质的配合物，形成絮状物沉淀，使酒得以澄清[23]。三是明胶溶于热水后形成可逆性凝胶，与带负电粒子结合，吸附酒中的浑浊微粒，使其成为小片状物而被除去，使酒达到澄清[24]。四是根据葡萄酒和果酒的国家标准，通过大量的试验确定透光率T>95%为澄清度合格，透光率T≥98%为非常澄清[25]。单一澄清剂壳聚糖、皂土、明胶加入到无核白葡萄酒中，透光率T均在97%以上，澄清度合格。但用到生产中，要考虑成本因素，壳聚糖14.2×104、皂土0.55×104、明胶0.65×104元/t。处理1 t无核白葡萄酒使用单一澄清剂壳聚糖的成本为35.5元，单一澄清剂皂土的成本为2.20元，单一澄清剂明胶的成本为1.95元，复合澄清剂壳聚糖-皂土-明胶(0.09 g/L -0.16 g/L -0.11 g/L)成本为13.10元。使用壳聚糖处理成本昂贵，采用单一澄清剂皂土、明胶处理无核白葡萄酒虽然成本虽低，但会使无核白葡萄酒颜色过淡。3种澄清剂复合使用从澄清方面还是从成本方面，都是优于单一澄清剂的，为无核白葡萄酒的酿造和实际生产提供理论依据。

前人关于葡萄酒澄清方面的研究有许多，但有关无核白葡萄酒澄清的研究尚未见报道，并且研究参考张宁波等[6]研究的赤霞珠葡萄酒，以及康超等[7]研究的山葡萄酒，最后得到的结果不尽一致，可以看出研究对象不同，澄清剂的选择以及添加量上也有所不同。

4 结 论

采用5种单一澄清剂果胶酶、明胶、壳聚糖、皂土、植酸分别对无核白葡萄酒进行澄清效果试验，得到壳聚糖、明胶、皂土3种澄清剂的澄清效果较好，以壳聚糖、皂土、明胶进行复合，采用Box-Behnken响应曲面法分析，确定无核白葡萄酒复合澄清剂的最佳用量为壳聚糖添加量0.09 g/L、皂土添加量0.16 g/L、明胶添加量0.11 g/L，透光率为98.45%(属非常澄清)。