紫花苜蓿内生解淀粉芽孢杆菌Ba09的分离及防效研究

李健，高兴祥，李美，房锋

（山东省农业科学院植物保护研究所，山东济南 250100）

紫花苜蓿（Medicago sativa）为豆科苜蓿属多年生草本植物，是我国种植面积最大的牧草，同时也是世界范围内种植时间最久的重要牧草之一［1，2］。在长期种植过程中，紫花苜蓿病害呈现出多样性和危害性增强的趋势，如根腐病和褐斑病等病害对紫花苜蓿产量造成严重影响。世界范围内，每年由病害导致苜蓿产量损失在20%以上［3］。目前苜蓿病害防控主要使用化学杀菌剂，虽对降低病害、苜蓿产量起到重要作用，但长期使用，不仅导致病菌产生抗药性，而且对苜蓿品质、安全、环境健康产生威胁［3-5］。因此，对于环境友好型微生物生防资源的需求越来越迫切。

植物内生菌是指一类存在于植物体组织内，但是并不引起生物病害的一类微生物的总称［6］。研究显示，植物内生菌功能复杂，部分内生菌对植物的正常生长发育起到一定的保护作用，在植物抵御病害过程中扮演重要角色［7，8］。植物内生菌类群多样，主要包括真菌、细菌和放线菌等，其中芽孢杆菌属（Bacillus spp.）是目前研究及应用较多的一类生防细菌。该类细菌在生长过程中往往能够通过代谢产物达到抑制植物病原菌生长的目的［9，10］。本研究从苜蓿中分离得到一株内生细菌Ba09，并对其进行分类鉴定和抑菌效果分析，为下一步开展苜蓿病害生物防治积累微生物菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株与样品采集 样品采集于山东省农业工程学院齐河院区苜蓿试验园，由山东省农业科学院植物保护研究所进行分离。

供试植物病原菌菌株：炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、镰刀菌（Fusarium oxysporum）、链格孢菌（Alternaria alternata），均保存于山东省农业科学院植物保护研究所。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g。

营养琼脂培养基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化钠 5 g，琼脂 15 g。

1.2 试验方法

1.2.1 紫花苜蓿内生菌的分离 紫花苜蓿叶片用清水反复冲洗干净、晾干；超净工作台内，75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3遍，5%次氯酸钠表面消毒3 min，无菌水冲洗3遍，晾干。将表面消毒后的叶片置于NA培养基平板上，光照培养箱内培养48 h后进行观察，并将产生的菌落转移到新的NA培养基中。对照用组织印记法检测表面消毒效果。

1.2.2 生防效果测定 采用对峙培养法［11］测定菌株对待测病原菌的拮抗作用。对峙培养7 d后，采用十字交叉法测量对照的菌落直径（mm）和对峙培养菌落直径（mm）并计算抑制率。抑制率（%）＝（对照菌落直径-对峙培养菌落直径）／对照菌落直径×100。显微镜下观察对峙培养病原菌边缘菌丝状态。

1.2.3 菌株的鉴定 NA培养基活化 Ba09菌株，28℃恒温培养5 d，观察菌落形态、颜色、凸起特征、边缘状态等。用TaKaRa细菌基因组提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit）提取基因组 DNA，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和F1541（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）扩增16S rRNA序列。扩增体系（25μL）：10×Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，引物各 1μL，Taq酶0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 18μL。PCR反应程序：94℃ 4 min；94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃ 10 min。回收 PCR产物，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

测序结果在NCBI进行BLAST比对，选取相似序列，采用MEGA 6.0和ClustalW进行系统进化分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定

经NA培养基培养发现，该菌株菌落不规则，整体近圆形，菌落边缘不整齐，上生皱褶，无光泽。扩增获得长度为1 469 bp的16S rRNA序列。BLAST序列比对发现，Ba09菌株的16S rRNA序列与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌等芽孢杆菌属序列同源性在99%以上。系统发育树结果（图1）显示，Ba09菌株与解淀粉芽孢杆菌亲缘关系更近，结合形态学观察，将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

图1 菌株Ba09系统发育树分析

2.2 Ba09菌株的生防效果

2.2.1 抑菌效果 对峙培养试验结果表明，Ba09菌株对待测病原菌均表现出不同程度的拮抗性（图2），抑制率在43.11% ～77.19%之间，其中对炭疽菌抑制效果最好，对镰刀菌抑制效果相对较差（表1）。

表1 Ba09对供试病原菌的抑制率

图2 菌株Ba09对供试病原菌的抑制效果

2.2.2 病原菌显微观察 显微观察显示，Ba09菌株对待测病原菌均表现出不同程度的拮抗性，在未发生菌落直接接触的情况下，供试病原菌的菌丝生长受抑制并出现扭曲、顶端呈球状膨大等现象（图3）。

图3 菌株Ba09抑菌显微观察

3 讨论与结论

目前主要通过使用化学药剂开展植物病害防控，不仅容易造成高抗性病原菌的产生，而且对生态环境也会造成污染。近年来，基于农业健康可持续发展的需求，通过代谢物抑菌或通过诱导系统抗性防治植物病害的环境安全型生物菌剂得到越来越多的重视。芽孢杆菌属细菌在自然界广泛存在，其生长迅速，产生的芽孢抗逆能力强，能够在多种环境下应用。研究发现，芽孢杆菌属细菌生长过程中均能产生对多种植物病原菌具有广泛抑制作用的物质［12］，芽孢杆菌及其代谢产物不但可以直接抑制病原菌的生长，而且能诱导寄主植物产生系统抗病效应［13］。荆卓琼等［10］研究发现，解淀粉芽孢杆菌HZ-6-3对番茄灰霉病的防控效果较好。胡进玲等［14］分离得到的解淀粉芽孢杆菌对苜蓿的多种病原菌均表现出良好的拮抗作用。

对峙培养过程中Ba09菌株未与待测病原菌菌丝体直接接触，但病原菌均受到不同程度的抑制，菌丝形态发生改变等，说明Ba09菌株是通过分泌抗生素物质或有毒代谢产物作用于病原菌，从而起到抑菌作用。Basha等［15］研究发现，芽孢杆菌抑菌过程可能与拮抗菌分泌的抗菌肽类或蛋白类物质有关，其中几丁质酶具有溶解植物病原菌细胞壁的能力，可能是芽孢杆菌拮抗病原菌的重要物质之一［16］。

本研究筛选得到一株紫花苜蓿内生菌，并鉴定为解淀粉芽孢杆菌。对峙试验和显微观察显示，其对多种植物病原菌均表现出良好的拮抗效果，具有一定的生防应用潜力，下一步将重点关注该菌株的抑菌机理及田间应用效果。