高含量猪去氧胆酸精制工艺的研究

徐宾朋，郭庆，赵露，赵厚发

（安徽科宝生物工程有限公司，安徽 淮北 235025）

猪去氧胆酸（Hyodesoxycholic Acid，HDCA）是猪胆汁的主要成分，具有降血脂、镇痉、祛痰作用，临床上用于高血脂症、气管炎以及由肝胆疾病引起的消化不良，其作为清开灵注射剂中的有效成分，经临床观察对急性白血病的治疗有良好作用，体外实验证明其具有诱导细胞凋亡、抑制细胞的增殖分裂作用，也是人工牛黄的重要原料[1-2]，同时也是半合成鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸的原料。

猪去氧胆酸的精制有如下方法，重结晶法；将猪去氧胆酸采用乙酸乙酯进行2次重结晶，得到高含量的猪去氧胆酸，但产品的收率将会大大降低[3]。甲酯化法；将HDCA转化为猪去氧胆酸甲酯-苯加成物后碱分解，调节pH、沉淀、得HDCA纯品；镁盐法：将粗HDCA转化为粗猪去氧胆酸镁后，酸化、结晶，得HDCA纯品，上述2种方法均需要将HDCA进行化学预处理，工艺步骤繁琐，生产周期长，其中使用的苯为致癌物质[4-6]。针对现有的高含量猪去氧胆酸精制中存在的问题。

本研究采用正交设计优选出最佳除杂工艺条件且进行了验证；对乙酯量、活性炭量及回流时间为考察因素对精制工艺进行正交实验优化,并对优选的精制工艺进行验证。

1 实验部分

1.1 材料

猪去氧胆酸对照品购自中国食品药品检定研究院，猪去氧胆酸粗品购自四川某生物公司。

1.2 仪器及试剂

ZL-2000磁力搅拌加热套、R1001N型旋转蒸发仪购自郑州长城科工贸有限公司；水浴锅、SHZ-5B型真空泵电热鼓风干燥箱购自巩义市予华仪器有限公司；TP-2000电子天平购自福州华志科学仪器有限公司；8205A型笔试pH 计购自上海康仪仪器有限公司；SHT型搅拌数显恒温电热套购自山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；Waters-1525型高效0液相色谱仪、Waters-2424型蒸发光散射检测器(美国沃特世科技有限公司)。氢氧化钠、浓盐酸、冰醋酸、乙酸乙酯购自滨化集团股份有限公司，工业级。

2 方法

2.1 工业步骤

称取猪去氧胆酸粗品，加水和氢氧化钠，加热至80℃，使其完全溶解，降温至50℃，加入澄清剂，继续加热至90℃，保温反应30 min，降至常温，过滤，收集滤液，调pH 2～3，得湿品猪去氧胆酸；将湿品猪去氧胆酸称重，加入乙酸乙酯，搅拌使其溶解后，加活性炭，加热回流，趁热精密过滤器过滤，浓缩乙酯层至出现白色颗粒状结晶，停止浓缩，降温冷却结晶，离心的高含量猪去氧胆酸湿品，60℃干燥2 h，80℃干燥2 h，称重得高含量猪去氧胆酸成品。

2.2 主要检测指标

2.2.1 熔点的检测方法

按照参考文献[1]的方法进行检测。

2.1.2 比旋度的检测方法

按照参考文献[1]的方法进行检测。

2.1.3 醇溶度的检测方法

按照参考文献[1]的方法进行检测。

2.1.4 残渣的检测方法

按照参考文献[1]的方法进行检测。

2.1.5 含量的检测方法

测定粗品和精品猪去氧胆酸的含量,依据参考文献采用高效液相色谱法，采用C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇∶乙腈∶冰醋酸(0.5%，质量分数)溶液(49∶20∶31)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，柱温为25℃，蒸发光散射检测器，漂移管温度为108℃，载气流速为2.8 L·min-1。

3 结果与分析

3.1 猪去氧胆酸除杂工艺的优化

3.1.1 制定因素水平表根据文献[8]及预实验结果,考察的因素及其范围确定如下:水用量的倍数、pH、澄清剂的量,选L9(34)的正交设计进行实验,每个因素设计3个水平,因素水平见表1。

表1 除杂工艺因素水平表

3.1.2 试验方法

称取CK191202批次猪去氧胆酸粗品100 g，按设计条件加水溶解，调pH溶解后，60℃加入澄清剂，85℃保温反应30 min，降至常温过滤，滤液用稀盐酸酸化至pH4.0，猪去氧胆酸析出，离心，干燥得猪去氧胆酸，按2.2法检测主要指标。

3.1.3 除杂工艺正交实验结果及统计分析

经SPSS18.0统计分析的结果见表2、表3。

方差分析因素的主次关系为A＞B＞C,其中A2＞A3＞A1,B1＞B2＞B3,C2＞C3＞C1,最佳的方案为A2B2C3。方差分析结果表明：A因素的影响具有显著意义(P＜0.05),B、C因素对收率的影响均不显著(P＞0.05)。

3.1.4 验证实验

从表2和表3实验结果看，最佳方案为A2B2C3，为验证上述工艺的正确性，做A2B2C3工艺验证试验。

表2 除杂工艺正交实验结果

表3 除杂工艺方差分析表

用不同批次的5批猪去氧胆酸粗品各称取100 g，按工艺A2B2C3做验证试验，测得猪去氧胆酸粗品得量和含量，计算收率,得出不同批次不同含量的原料，通过优化的除杂工艺，收率和醇溶度均合格，说明除杂工艺的最佳工艺条件为A2B2C3，即10倍量的水，pH 11.5,质量分数为1.5%的澄清剂，可以满足不同的原料的除杂。验证结果见表4。

表4 不同批次的验证实验结果

3.2 猪去氧胆酸精制工艺的优化

3.2.1 粗品制备

称取CK191210批猪去氧胆酸2 kg，加20 kg的水，调pH 11.5，加热至60℃，加30 g澄清剂（溶于质量分数为1%的冰醋酸），保温反应30 min，降温至常温，过滤，滤液用稀盐酸酸化至pH 4,抽滤，干燥得猪去氧胆酸粗品1 632 g,得率81.6%,质量分数为95.5%，收率97.4%。

3.2.2 制备因素水平表

根据文献[8]及预实验结果,考察的因素及其范围确定如下:乙酸乙酯量、活性炭用量和回流时间，选L9(34)的正交设计进行实验,每个因素设计3个水平,因素水平见表5。

表5 精制工艺正交因素水平表

3.2.3 精制工艺

称取猪去氧胆酸粗品100 g，分别按照L9(34)表中设计的条件进行精制，加乙酸乙酯，活性炭，加热回流，精密过滤器去除活性炭，滤液浓缩至出现白色颗粒结晶时，停止浓缩，取出降温冷却结晶，抽滤结晶，滤液再次浓缩结晶，合并结晶，干燥，取样检测猪去氧胆酸的含量和残渣。

3.2.4 精制工艺正交实验结果及统计分析

计算结果及方差分析结果见表6和表7。

表6 精制工艺正交的试验结果

表7 精制的方差分析表

从表6和表7中可以看出，三种因素的影响程度依次为：A＞B＞C。其中A3＞A2＞A1,B2＞B3＞B1,C1＞C2＞C3，A因素的影响具有显著的意义(P＜0.05)，B、C因素对收率的影响均不显著(P＞0.05)。最佳的精制工艺条件为A3B2C1，即12倍量的乙酸乙酯、质量分数为3%的活性炭，加热回流1 h。

3.2.5 工艺验证

选择除杂工艺中的相对应的5批粗品，进行工艺验证，按照最佳工艺条件即12倍量的乙酸乙酯、3%的活性炭，加热回流1 h。结果与正交实验中收率最高的序列8吻合，说明了该最佳工艺条件，针对不同含量的粗品均可达到高含量和高收率，从而证明该最佳精制工艺的稳定性和合理性。结果见表8。

表8 精制最佳工艺的验证结果

4 结 论

最佳除杂工艺为水量是10倍量、pH 11～12，澄清剂质量分数为1.5%；最佳的精制为工艺乙酸乙酯用量为12倍量、活性炭的用量为3%，回流时间1 h。

通过实验本精制工艺对原料的选择，控制在低含量的猪去氧胆酸的质量分数不低于75%且残渣不大于1%，为高含量猪去氧胆酸精制的最低标准。一般粉末的活性炭不能满足吸附脱色的效果，必选选择医用767的活性炭，且使用前需105℃活化4 h。