一株优良野生葡萄酒菌株的性能分析

葛含静

（陕西学前师范学院 生命科学与食品工程学院，陕西西安 710100）

在酿制葡萄酒的过程中，酵母的种类与性能对成品的品质具有无可替代的影响。不同种类、不同来源的酵母，其代谢途径必有差异，导致所酿酒的色泽和风味便会有所不同[1-2]。目前，国内葡萄酒企业获取葡萄酒酿造酵母的主要途径有2 种，即利用当地特有的葡萄资源选育优良的本土酵母，或进口国外优良的葡萄酒酿造酵母。自然发酵葡萄酒时，附着在葡萄果实、果梗，甚至叶片上的酵母都会参与酒的发酵，从而使酒液具有独特的地域性品质[3]。各年份各批次之间酒的品质不能稳定，存在或多或少的差异[4]。为了使葡萄酒品质稳定，许多酒企大量使用国外优良酵母进行发酵，这样虽能稳定发酵速度和风味，但极大降低了本土酵母的贡献，导致产品同质化严重，难以凸显酒的地域特色[5-7]。研究利用本土特有葡萄资源，通过自然发酵筛选出的优势酿造酵母对当地微环境的适应性非常好，易于在酿造过程中发挥主导作用，并能很好地保证产区的典型 性[4，8]。因而，本土酿造酵母的选育研究成为当下葡萄酒行业的研究热点之一[9]。

西安拥有多个成熟、规模化的葡萄种植基地，本土化的葡萄酒酿造酵母资源极为丰富。作为西安地区特有的兼鲜食与酿造的葡萄品种，户太八号果粒深紫味道甜美，是酿造葡萄酒的优质原料。对前期筛选出的适合户太八号桃红葡萄酒酿造的菌株NJ7进行鉴定，并对发酵条件进行优化，对所酿酒样品质进行分析，并将之与商品酿酒酵母D254 所酿酒样的品质进行比较，为酿造出具有西安本土特色的葡萄酒提供试验数据。

1 试验材料与培养基

1.1 试验材料

成熟户太八号葡萄，2017 年9 月采集于西安市白鹿原产区，破碎、压榨后自然酿制；商品酿酒酵母D254。

1.2 培养基

WL营养琼脂培养基[10]，无机盐类KH2PO40.55 g/L，KCl 0.425 g/L，CaCl20.125 g/L，MgSO40.125 g/L，FeCl30.025 g/L，MnSO40.0025 g/L，溴酚绿0.022 g/L，pH 值5.5。

保藏培养基、活化培养基，均为YPD 培养基。

上述培养基均在121 ℃下高压灭菌15 min 后备用，所有试剂均为分析纯或生物纯。

2 试验方法

2.1 菌种鉴定

表型鉴定[11-12]：菌株NJ7 接种于WL 营养琼脂培养基，于25 ℃条件下培养72 h，观察菌落形态及细胞形态。

分子生物学鉴定[13-14]：珠磨法提取菌株NJ7 基因组DNA，以之为模板，NL1 和NL4 为引物，对26S rRNA D1/D2 区域扩增并测序，进行系统发育分析，确定菌株NJ7 的生物学地位。

2.2 发酵工艺参数优化

在1 L 葡萄鲜浆中按3%接种量（V/V） 接入菌株NJ7 种子液，并加40 mg/L 二氧化硫溶液，恒温发酵72 h，依据酒样酒精度优化菌株NJ7 的最适发酵温度和pH 值。

2.3 酒样品质分析

以1.0%接种量（V/V） 接种菌株NJ7 的种子液于装有10 L 葡萄鲜浆的发酵罐中，并加入40 mg/L二氧化硫溶液，于25 ℃条件下发酵5 d 后取样，以转速5 000 r/min 离心，测定所酿酒样的酒精度、总酸、总糖等理化指标，以酒样的滋气味、澄清度等作为感官指标。采用商业菌株D254 作对照菌株。最后，通过小试试验来验证优化后的适合菌株NJ7 的发酵条件。

2.4 香气成分分析

GC-MS 分析。取6 mL 酒样，于40 ℃下水浴加热15 min，顶空萃取35 min，解析5 min[15]，以D254作对照。升温程序与色谱条件同文献15。

3 结果与分析

3.1 菌种鉴定

菌株NJ7 的菌落形态和个体形态见图1。

图1 菌株NJ7 的菌落形态和个体形态

菌株NJ7 的菌落呈球形突起且表面光滑，奶油色，略带淡绿，不透明（图1（a）），具有典型酿酒酵母的形态特征；菌体卵圆形，单端芽殖（图1（b））。

菌株NJ7 的26S rRNA 序列扩增产物见图2，菌株NJ7 的系统发育树见图3。

图2 菌株NJ7 的26S rRNA 序列扩增产物

图3 菌株NJ7的系统发育树

菌株NJ7 与S. cerevisiaeAB733454.1 同枝，26S rRNA 序列相似度为100%。结合表型鉴定结果，菌株NJ7 应为酿酒酵母。

3.2 发酵工艺优化与酒样品质分析

菌株NJ7 发酵温度优化见图4，菌株NJ7 发酵pH 值优化见图5。

图4 菌株NJ7发酵温度优化

图5 菌株NJ7发酵pH 值优化

由图4、图5 及小试发酵验证试验可知，菌株NJ7 最优发酵条件为发酵温度24 ℃，pH 值5.0。

菌株NJ7 和D254 所产酒样的理化指标见表1，菌株NJ7 和D254 所产酒样的感官评定结果见表2。

表1 菌株NJ7 和D254 所产酒样的理化指标

表2 菌株NJ7 和D254 所产酒样的感官评定结果/分

由表1 和表2 可知，2 株菌所产酒样的各项指标非常接近；菌株NJ7 酒样的色度和花色苷含量略低，其余指标均高于D254 酒样。综上，菌株NJ7 具有良好的产业化应用价值。

图6 菌株NJ7 所酿酒样香气成分GC-MS 总离子图

图7 D254 所酿酒样香气成分GC-MS 总离子图

3.3 酒样香气成分分析

菌株NJ7 所酿酒样香气成分GC-MS 总离子图见图6，D254 所酿酒样香气成分GC-MS 总离子图见图7，菌株NJ7 与菌株D254 所酿酒样主要香气成分对比见表3。

由表3 可知，菌株NJ7 和D254 所酿酒样中分别可检出挥发性化合物64 种与53 种，主要香气成分均为醇、酯和酸；与D254 相比，菌株NJ7 酒样中优势含量的香气成分有16 种，2- 庚醇、壬醛、异戊酸乙酯等香气良好，正己醇、苯乙醇、乙酸异戊酯等香气优雅；各种香气成分与特有组成比例形成了菌株NJ7 所酿酒液的独特风味。

4 结论

前期研究中获得的优良菌株NJ7 经鉴定是酿酒酵母，发酵酿制的户太八号酒样理化指标均接近商品酿酒酵母D254，发酵性能良好，具有工业化应用潜力，可作为西安地区葡萄酒酿制的特征酵母商品化的出发菌。