液相色谱串联质谱法测定饲料中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物

◆作者：庄姜云 唐媛媛 黄武 伍志强 詹海毅

◆单位：1.湛江市海关技术中心食品实验室；2.中国检验验证集团广东有限公司湛江分公司

孔雀石绿和结晶紫是一类三苯甲烷类染料，最先应用在纺织工艺，因其具有消毒和杀菌作用而被广泛应用于水产养殖过程中。孔雀石绿是一种极易溶于水，它可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，用作抑菌剂或杀阿米巴原虫剂（迈新等，2000）,所以有水产品养殖者向饲料中直接添加孔雀石绿，用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病等（邱绪建等，2006；翟毓秀等，2007）。由于孔雀石绿和结晶紫具有高毒、高残留和致癌、致畸、致突变等特点，当其进入生物体内，会产生具有更强危害的隐色孔雀石绿和隐色结晶紫。因此，包括中国在内的许多国家都将其列为水产养殖中的禁用药物。2019 年12 月27 日，我国农业农村部将孔雀石绿列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单，同时禁止用于所有食用动物的饲养环节。

广东省湛江市是一个水产养殖丰富的沿海城市，这里有不少水产饲料生产企业，同时也进口大量鱼粉、虾片等饲料以满足水产养殖的广阔市场。由于鱼粉是饲料中动物蛋白的主要来源,含有孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的鱼粉添加到饲料中, 会通过食物链威胁人类身体健康。因此，加强对饲料安全监管，建立对饲料中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留的检测方法十分必要。目前研究报道的水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留检测方法较多，而与饲料中同时检测这四种残留物的相关研究报道较少，本文主要结合实验室日常检测工作，通过固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时检测饲料中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的残留量（GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》；NY/T 1756-2012 饲料中孔雀石绿的测定 液相色谱- 串联质谱法），确定了准确、快速、低成本的前处理方法，以供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

安捷伦液质联用仪G6400系列三重四极杆质谱，配ESI 离子源；Agilent24 孔的固相萃取仪；离心机，Anke TDL-5-A,Anke LXJ-ⅡB；氮吹仪；涡旋混匀器；超声波清洗器，SB5200DDT。

1.2 试剂和材料

乙腈(液相色谱级)；甲酸(液相色谱级)；5 mol·L－1乙酸铵缓冲溶液；中性氧化铝柱（1000mg/6mL），使用前用5mL乙腈活化柱子；中性氧化铝，层析用。标准品：孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐性结晶紫均购买于Dr.Ehrenstorfer 公司,纯度99.0%以上。

标准溶液：孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫和隐性结晶紫标准储备溶液（500mg/kg），分别称量10mg（精确到0.1 mg）于不同的25mL 棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度。孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫和隐性结晶紫标准第一中间液（10mg/kg），分别吸取0.50mL标准储备液（500mg/kg）于25mL容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度。孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫和隐性结晶紫标准第二中间液（1mg/kg）：准确吸取1.0mL 第一标准中间液（10mg/kg） 于10mL 容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度。

标准混合工作溶液(20μg/kg)：准确吸取0.2mL 标准第二中间液（1mg/kg）于10mL 容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度。准确移取适量上述MG、LMG、CV、LCV 标准工作溶液配成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/kg 的基质标准曲线。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Xdbc18 5μm 柱（4.6×50mm）；流动相：溶剂A 为0.1%甲酸水溶液+5mMol/L 乙酸铵水溶液，溶剂B为乙腈，洗脱梯度见表1，进样量5μL；柱温35℃；流速：7L/min。

1.3.2 质谱条件

离子化方式：ESI，正离子检测；监测方式：MRM；雾化气NEB：45；碰撞气CAD:9；电离电压：3500V；离子化温度：500℃。Q1 和Q3 均为单位分辨率。主要质谱参数见表2。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

表2 主要质谱参数

1.4 定性标准

1.4.1 保留时间

根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测液中孔雀石绿、隐性孔雀石绿的响应值均应在仪器线性响应范围内。参考保留时间为3.06min(孔雀石绿)、5.39min(隐性孔雀绿)、3.55min (结晶紫）、5.43min(隐性结晶紫)。在同一测定条件下，样品中待测物质与同时检测的标准品的定性峰值保留时间相同，偏差为±2.5%。

1.4.2 信噪比

待测化合物的每一个重构离子色谱图的信噪比大于等于3。

1.4.3 定量离子、定性离子及子离子丰度比

各项化合物的质谱定性离子必须出现，并且同一检测批次对同一种化合物，两个子离子的相对丰度比与标准溶液相比变化范围应为20%以内。

1.5 样品的提取

称取粉碎后的样品2.0g（精确至0.001g）于50mL 离心管中，依次加入约0.5g 中性氧化铝（6.1.3）和5mL 乙腈，振荡器激烈震荡15min，超声提取30 min，4000rpm 离心10min，移取上清液于50mL 具塞比色管中。样品再加入5 mL 乙腈，该提取液留作第二次提取用，振荡器激烈震荡15min，超声提取30 min，4000rpm 离心10min，移取离心后的上清液合并至50mL 具塞比色管中。

1.6 样品净化

用5mL 乙腈活化中性氧化铝柱，取上清液10mL 过柱,常压下流出，再用2mL乙腈冲洗柱子，收集全部流出液，在40℃下用氮气吹干，用2.0mL 乙腈- 水（1+1）定容，旋涡震荡1min，1000rpm 离心10min,溶液过0.22μm 有机相滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

对4 种化合物进行定量分析，制备工作曲线。加化合物制成 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/kg的系列标准浓度，按设定的色谱条件进行仪器分析，以标准溶液浓度为横坐标，以响应值为纵坐标，进行线性回归，见表3。

由表3 可见，4 种化合物标准工作曲线的标准平方的偏差值大于0.995，质量浓度为0.5～8.0μg/kg 时线性良好。

2.2 回收率和精密度

取南美白对虾饲料样品进行加标回收率实验，系统考察方法的准确度和精密度。分别进行0.5、1.0、4.0μg/kg 添加浓度的回收率实验，每个浓度做6 个平行，分别计算回收率和相对标准偏差，回收率实验结果见表4。

从回收率结果可以看出，南美白对虾饲料样品为0.5～4.0μg/kg添加浓度时，平均回收率为93.5%～117.8%，相对标准偏差＜3.3%，可见本方法能满足饲料中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测。

表3 不同化合物的线性回归方程与线性范围

表4 不同浓度中四种化合物的添加回收率和精密度

2.3 前处理方法的优化

目前乙腈是提取孔雀石绿的最佳溶剂（窦红，2010；詹月华等，2009）。但是溶解能力强的乙腈也极易溶解其他杂质，从而影响结果，而且大量使用纯乙腈易造成溶解费用大、毒性污染大。本方法用了10mL 乙腈溶剂提取，提取量少，减少环境的污染。

2.4 固相萃取柱的选择

由于饲料中含有浓重的色素、脂肪、粉尘等细小颗粒，且大部分易溶于水溶液，所以需要通过固相萃取柱来净化。由于样品的净化，用中性氧化铝柱串接在丙基磺酸阳离子树脂PRS 柱上，成本高，消耗试剂多，对环境污染大。所以本实验只用了中性氧化铝柱，回收率高和线性良好，降低实验的成本。

3 结论

本文研究饲料中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的液相色谱－串联质谱前处理条件。通过乙腈的提取量选择和净化方式的选择、方法的回收率以及线性范围进行了探讨。由于方法的改进更利于降低检测成本，使检测低限可以达0.5μg/kg，可操作性强。该方法总体而言，精密度好，灵敏度高，能简便、廉价、快速、准确地测定饲料中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物，对于饲料中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测有一定意义。

参考文献：（略）