重组小鼠白细胞介素11致小鼠心肌纤维化的实验探究*

陈雨露，汪新宇，郑舒展，杜延飞△，叶 强，李家富，范忠才，李 光

（1西南医科大学附属医院心内科，医学电生理学教育部重点实验室，2西南医科大学心血管医学研究所，医学电生理学教育部重点实验室，四川泸州646000）

纤维化是多种心血管疾病终末期的共同病理表现［1］，其发生在心脏时，会引起心肌结构和电活动的紊乱［1-2］，最终导致心脏功能障碍和心力衰竭，成为心血管病患者致残致死的主要原因［3］。心肌纤维化的本质特征是心肌成纤维细胞大量增殖、活化以及分泌过多的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），包括Ⅰ型、Ⅲ型胶原和纤连蛋白等［4］。心肌纤维化的发生机制复杂且尚未完全阐明，目前临床上仍缺乏有效的抗心肌纤维化药物。因此，进一步阐明心肌纤维化的病理形成机制以及寻找新的纤维化干预靶点和治疗药物十分重要。

白细胞介素11（interleukin-11，IL-11）是IL-6 细胞因子超家族成员之一［5］，具有多种生理功能。最初，IL-11被发现能够促进血小板生成［6］，后来随着研究的深入被发现与很多恶性肿瘤的发生发展密切相关，如上皮源的胃癌、肠癌和乳腺癌等以及造血系统的白血病和多发性骨髓瘤等［7-8］。近几年，IL-11 又被发现一新的功能，即作为病理因子参与多种器官纤维化的发生发展，且可能成为治疗纤维化疾病的一个关键靶点［9-11］。但是，对于IL-11 功能的这一新的认识，尤其是IL-11 与心肌纤维化关系，国内还尚未见相关报道。另外，重组人IL-11 近年来常被用于临床上恶性肿瘤患者化疗后血小板减少症的治疗［12-13］，虽然显示出不错的疗效，但IL-11这一新功能提醒我们它的使用有可能造成器官纤维化的严重毒副作用，因此我们呼吁大家有必要重新审视重组人IL-11 在临床上的使用。故本文拟通过观察皮下注射重组小鼠白细胞介素11（recombinant mouse IL-11，rmIL-11）对小鼠心脏结构功能的影响以确定IL-11 的病理促纤维化作用，证实前人观点同时为心肌纤维化研究提供一种全新的可靠的动物模型建立方法，还为国内心肌纤维化的防治提供新的靶点、思路和理论依据。

材料和方法

1 实验动物

SPF 级成年雄性 C57BL/6 小鼠 20 只，购自成都达硕实验动物有限公司，实验处置符合动物伦理学标准。

2 主要试剂

rmIL-11 购于上海优宁维生物股份有限公司；RIPA（强）裂解液、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液、超敏ECL 化学发光试剂盒（P0018S）以及兔源抗GAPDH抗体购于上海碧云天生物技术有限公司；HE染色试剂盒和Masson染色试剂盒购买于北京索莱宝科技有限公司；兔抗鼠collagen Ⅰ、collagen Ⅲ及fibronectin抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗兔Ⅱ抗购于上海生工生物工程股份有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。

3 主要方法

3.1 实验分组 将20 只C57BL/6 小鼠随机分为实验（rmIL-11）组和对照（control）组，每组10 只。实验组小鼠背部皮下注射 rmIL-11（100 µg·kg-1·d-1），连续注射3 周。对照组小鼠皮下注射等量的生理盐水。

3.2 超声心动图检测小鼠心功能 采用异氟烷气体麻醉小鼠。小鼠呈仰卧位，将其四肢固定，脱毛膏除尽胸部毛，使用Vevo 3100 型小动物超声仪，探头置于胸部，测量评价左室舒张末期内径（left ventricu‑lar end-diastolic diamension，LVEDd）、左室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension，LVEDs）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左室短轴缩短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）等心功能指标。

3.3 心重指数（cardiac weight index，CWI）的测定实验结束后第2 天，2 组小鼠分别称重，然后麻醉状态下剪开胸部摘取心脏，称重，计算CWI。CWI（mg/g）=全心重（mg）/体重（g）。

3.4 小鼠心脏HE 染色和Masson 染色 小鼠心脏标本经固定、石蜡包埋、切片一系列操作后，按照试剂盒说明书分别进行HE 和Masson 染色，观察心脏组织病理变化及心肌纤维化的程度，采用Image-Pro Plus 6.0 软件分析心肌胶原容积分数（collagen vol‑ume fraction，CVF）。CVF（%）=胶原的面积/总面积×100%。

3.5 Western blot 检测ECM 蛋白的表达水平 取2组小鼠左室组织，用RIPA（强）裂解液提取总蛋白，然后BCA 法测定各组样品蛋白浓度。取50µg 总蛋白进行SDS-PAGE，之后湿转法将蛋白转印至PVDF膜上。室温5%脱脂牛奶封闭1 h，洗膜，然后放入兔抗 鼠 collagen I、collagen Ⅲ 及 fibronectin 抗 体（1∶1 000），4℃摇晃孵育过夜，洗膜，再用HRP 标记山羊抗兔Ⅱ抗（1∶2 000）室温孵育1 h，洗膜。ECL 化学发光液反应后于Bio-Rad 成像系统曝光显影，Image-Pro Plus 6.0软件分析蛋白条带灰度值。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0 软件进行数据处理和统计分析。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 超声心动图评价小鼠心功能

与对照组相比，rmIL-11 注射组小鼠的LVEF 和LVFS 明显降低（P＜0.05），说明左室收缩功能下降；而LVEDd 和LVEDs 均明显增大（P＜0.01），说明左室心腔扩大，见图1。该结果表明rmIL-11 能使小鼠心功能明显变差。

2 小鼠CWI的比较

与对照组相比，rmIL-11 注射组小鼠的CWI 明显增大（P＜0.01），见图2。

3 小鼠心室肌的HE和Masson染色观察

HE染色和Masson染色结果分别如图3和图4所示，对照组的心肌细胞排列整齐，形态规则，细胞间仅有少量的蓝色胶原纤维；而rmIL-11组的心肌细胞排列紊乱，凋亡增多，且细胞间可见大量胶原纤维沉积。CVF计算结果显示，rmIL-11组较对照组明显升高（P＜0.01）。

4 rmIL-11 对小鼠心肌组织ECM 相关蛋白表达的影响

Western blot 实验结果显示，与对照组相比，rmIL-11 组小鼠心肌组织中的 collagen Ⅰ、collagen Ⅲ及fibronectin 等ECM 组分蛋白表达均明显升高（P＜0.05），而这些蛋白的过量表达、沉积是导致纤维化发生的直接原因，见图5。

Figure 2.Comparison of CWI between control and rmIL-11groups.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group.图2 两组小鼠的CWI比较

Figure 3.The images of mouse myocardial tissues with HE staining（×100）.图3 小鼠心肌组织的HE染色图像

讨 论

近年来，心血管疾病的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，已成为威胁人类健康的头号杀手。心肌纤维化是诸如心肌肥厚、心肌梗死以及心律失常等多种心血管疾病发展到一定阶段的共同病理生理过程，最终可导致心脏功能衰竭，是心血管疾病发病和死亡的重要原因。因此，抑制或逆转纤维化成为治疗心血管疾病的一种重要策略，而寻找新的纤维化干预靶点和治疗药物是心肌纤维化防治的关键。

IL-11 是一种具有多种生物学功能的细胞因子。近年来，大家对其的关注点主要集中在IL-11 与恶性肿瘤发生发展关系的研究上。同为IL-6 细胞因子超家族的成员，IL-6 的致纤维化作用目前已有不少文献报道［14-16］，但IL-11 是否具有类似病理作用却多年来一直未见报道。IL-11 的重要性被忽视和误解如此长时间，主要原因之一是，一篇于2010 年发表在国际顶级医学期刊《循环》的研究报道，重组人IL-11（rhIL-11）通过激活STAT3信号途径明显减轻小鼠心肌梗死后的心肌纤维化程度［17］，从而引导大家认为IL-11 具有抗心肌纤维化作用，是一个心肌保护因子。此外，近年来另有不少研究都表明IL-11 是一个保护性的和抗炎症的细胞因子［18-21］。直到2017 年底，IL-11 的真正面纱才被揭开，即 Schafer 等［9］发表于《自然》杂志的最新研究表明：IL-11及其受体特异高表达于活化后的心肌成纤维细胞中，且重组IL-11能诱导心肌成纤维细胞过度增殖、活化及ECM 蛋白合成；同时证明IL-11 是包括TGF-β1 在内的众多经典促纤维化因子发挥促纤维化作用必须的下游信号控制点；靶向抑制IL-11 却能明显减轻模型小鼠的心肌纤维化程度。因此，该研究团队提出，IL-11 是心血管纤维化的一个重要决定因子，同时是心血管纤维化的一个潜在治疗靶点，这一发现得到了其他学者高度评价［22-23］。该团队还称将IL-11 作为治疗靶点，有其优越性，因为 IL-11 位于 TGF-β1 下游，抑制其表达可以避免类似抑制TGF-β1 的严重副作用。不仅如此，IL-11 的病理致纤维化作用同样被该团队在后续的肾脏［9］、肝脏［10］以及肺［11］纤维化研究中所证实，而该团队同时也证明靶向抑制IL-11 信号后这些器官的纤维化状况都明显减轻，相关的研究成果分别发表在国际顶级期刊《自然》、《胃肠病学》和《科学转化医学》上。此外，Strikoudis 等［24］的最新研究也表明IL-11 在Hermansky-Pudlak 综合征（HPS）患者的肺纤维化形成中起关键性作用，而对其敲除后发现在引入HPS4 突变的人肺类器官模型中纤维化发生明显减轻，同样证明了IL-11 的病理促纤维化作用和纤维化疾病潜在治疗靶点这一观点。在本实验中，我们通过对小鼠皮下注射给药rmIL-11，对IL-11的致心肌纤维化作用在体内做进一步验证，结果表明IL-11 确实能诱导小鼠心肌发生纤维化病变，证实IL-11是一个新型关键的促纤维化致病因子。

Figure 4.The images of myocardial collagen with Masson staining（×400）and the collagen volume fraction（CVF）in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group.图4 小鼠心肌胶原纤维的Masson染色图像及胶原容积分数

Figure 5.The protein levels of collagen Ⅰ，collagen Ⅲ and fibronectin in myocardial tissues were determined by Western blot.Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图5 Western blot检测2组小鼠心肌中Ⅰ型、Ⅲ型胶原及纤连蛋白的蛋白表达水平

目前动物心肌纤维化造模的方法有：腹主动脉部分结扎致心肌纤维化、冠状动脉结扎致心肌纤维化、糖尿病心肌纤维化、自发性高血压大鼠心肌纤维化以及异丙肾上腺素致心肌纤维化等。其中最常用也最简单的方法是皮下注射异丙肾上腺素诱导心肌缺血损伤而导致纤维化。但小鼠注射异丙肾上腺素诱导心肌纤维化文献较少，且各文献对异丙肾上腺素的给药剂量、时间间隔及总时长报道不一致，并且在造模过程中若注射剂量过大很容易导致小鼠直接死亡，而剂量过小往往不易形成纤维化模型［25］。本实验中，我们通过对小鼠皮下注射rmIL-11，剂量为100µg/kg，每天1次，连续注射21 d，结果使小鼠心肌发生明显纤维化病变。因此，本实验可为心肌纤维化的研究提供一种新的可靠的动物模型建立方法。

值得注意的是，近年来rhIL-11 常被作为药物用于临床上一些重大疾病的辅助治疗，如急性心肌梗死［26］、白血病［12］以及实体肿瘤［13］等，虽然显示出了一定的疗效，但可以推测它的使用很有可能引发多器官纤维化的严重副作用。而且国内确实存在关于注射用rhIL-11 引发患者心律失常、心衰等严重不良事件的文献报道［27-28］。因此，我们呼吁大家有必要重新评估rhIL-11在临床上的使用。

综上所述，本研究表明rmIL-11 能诱导小鼠心肌发生纤维化病变，证实IL-11 是一个新型的关键促纤维化因子，同时也为心肌纤维化研究提供一种新的可靠的动物模型建立方法。再结合文献报道，更重要的一点，IL-11 可能还是纤维化疾病的一个潜在治疗靶点。