不同喂养方式对先天性巨细胞病毒感染新生儿病毒载量的影响

杨洋，王春晖，王宝西，王琳

1.空军军医大学第二附属医院儿科，陕西 西安 710038；2.长安医院儿科，陕西 西安 710016

先天性巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染是新生儿出生2周内被CMV感染母亲传染引起，全球活产新生儿CMV感染率约0.7%，CMV感染可导致新生儿感音神经性耳聋、视力障碍、智力发育迟缓等疾病[1]，严重影响其生长发育，降低其生活质量，给患儿、家庭及社会带来严重的不良影响。早期发现CMV感染是预防胎儿宫内感染和新生儿感染的主要途径，但对于已感染患儿，如何进行良好的干预十分重要。其中，对于CMV感染新生儿其喂养方式尚存较大争议，母乳喂养是否增加CMV感染新生儿CMV病毒载量尚无一致性结论。本研究探讨母乳喂养与人工喂养对CMV病毒载量的影响，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年7月至2019年6月空军军医大学第二附属医院儿科诊治的82例CMV感染无症状新生儿为研究对象。纳入标准：①CMV病毒血清学证实母亲为原发性CMV感染；②新生儿出生2周内经实时荧光聚合酶链反应检测到CMV[2]；③足月产。排除标准：①先天性心脏病、畸形、早产儿；②先天性免疫缺陷性疾病；③母亲妊娠期间合并糖尿病、高血压等其他合并症或并发症。根据喂养方式不同将其分为两组，观察组31例，采用母乳喂养，其中男性19例，女性12例；日龄2～11 d，平均(5.32±2.16)d；出生方式：剖宫产20例，阴道分娩11例；出生孕周36～41周，平均(38.25±2.61)周。对照组51例，采用人工喂养，其中男性 29例，女性 22例；日龄 3～12 d，平均(5.39±2.05)d；出生方式：剖宫产33例，阴道分娩18例；出生孕周37～42周，平均(38.61±2.15)周。两组新生儿性别、日龄、出生方式、出生孕周比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，患儿家属均知情并签署同意书。

1.2 方法 对照组新生儿采用配方牛乳制品喂养，喂养量根据每日婴儿日需能量(100～120 kcal/kg)计算[3]。观察组新生儿采用纯母乳喂养，根据新生儿需求随时进行母乳喂养。

1.3 CMV病毒载量检测 所有新生儿均于出生后3 d内、1个月、3个月、6个月(观察组于新生儿出生1个月、3个月、6个月)采集母乳、采集唾液或尿液标本检测CMV DNA，72 h内完成检测。实时荧光定量PCR法：具体步骤：①DNA模板提取：分别吸取50μL的阴性、弱阳性与强阳性质控品于离心管，加入TRIzol(美国Invitrogen公司)提取总RNA，ND-1000紫外分光光度计(NanoDrop公司)检测RNA纯度和完整性。取20μg总RNA，采用M-MLV逆转录酶(Epicentre公司)将RNA逆转录为cDNA，反应体系20μL，反应条件：15℃ 30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min 灭活。②实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测：CFX96实时荧光PCR仪(美国Bio-Rad)检测CMV DNA水平，qRT-PCR流程：将吸104、105、106、107copies/mL阳性参考品2μL置于PCR管，加入qRT-PCR反应体系，反应液配制如下：0.4μL PCR引物F(10μmol/L)，0.4μL PCR 引物R(10 μmol/L)，1 μL PCR缓冲液(10×)，1μL dNTP(2.5 mmol/L)，0.6 μL氯化镁溶液，0.5 U Taq聚合酶，0.2μL ROX Reference Dye，2.5μmol/L荧光染料SybergreenI，加水至8μL。反应条件：95℃变性15 s 65℃退火20 s；75℃延伸15 s，共40个循环。扩增反应结束后根据中华医学会儿科学分会感染消化学组制定CMV感染诊断方案对新生儿CMV载量进行判定[4]，试剂盒均购自北京贝尔生物工程有限公司，检测流程严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 随访 所有新生儿均定期采用门诊定期复查或电话形式进行随访，随访至出生后6个月，复查内容包括外周血肝功能检测、头颅B超检测脑发育情况、外周血常规分析，听力筛查等。

1.5 统计学方法 应用SPSS25.0统计软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，采用重复测量方差分析及独立样本t检验，计数资料比较采用χ2检验比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组母乳CMV DNA载量比较 观察组母亲乳汁中CMV DNA载量在出生后1个月、3个月、6个月分别为(3.12±0.62)×103、(2.69±0.35)×103、(2.64±0.37)×103，观察组母亲乳汁中不同时间段的CMV DNA载量比较差异无统计学意义(F=1.032，P＞0.05)。

2.2 两组新生儿的CMV DNA病毒载量比较 两组新生儿出生3 d内、出生1个月、3个月、6个月CMV DNA病毒载量比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 两组新生儿不同时间的CMV DNA病毒载量比较(±s，×105)

表1 两组新生儿不同时间的CMV DNA病毒载量比较(±s，×105)

组别观察组对照组t值P值例数31 51出生后3 d 2.62±0.51 2.51±0.62 0.635 0.241出生1个月1.85±0.95 1.92±0.73 0.195 0.868出生3个月1.82±0.92 1.71±0.75 0.352 0.749出生6个月1.69±0.62 1.62±0.53 0.036 0.956 F值1.236 1.623 P值0.169 0.098

2.3 两组新生儿的随访结果比较 所有患儿均获得随访，出生后3 d、3个月、6个月听力筛查观察2例未通过，对照组1例未通过，肝功能检查观察组1例丙氨酸氨基转移酶偏高，对照组均正常，头颅B超均未发现脑发育异常，血常规检测观察组1例中性粒细胞减少，1例贫血，对照组1例贫血，两组肝功能异常、脑发育异常、中性细胞减少、贫血、听力异常检出率比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 两组新生儿随访结果比较[例(%)]

3 讨论

CMV是人体感染细胞肿大形成的巨大核内包涵体，胎儿宫内CMV感染可导致出生缺陷或畸形，新生儿CMV感染可影响其生长发育。据报道10%～15%的CMV感染患儿在生长发育过程中可能产生感音性神经性耳聋及认知和神经损害症状等后遗症[5]。新生儿CMV感染通过产道、输血、哺乳3种途径获得，其中母乳传播是围生期CMV感染的主要影响因素[6]。母乳CMV阳性婴儿是否可以给予母乳喂养，母乳喂养是否可增加新生儿CMV病毒载量或导致继发CMV感染性尚存争议。

本研究观察乳汁CMV阳性产妇在新生儿出生后1个月、3个月、6个月CMV DNA载量均≥1×103，均为阳性，但其载量并无显著变化。CMV阳性乳汁喂养新生儿是否对新生儿CMV DNA载量产生影响？本研究进一步观察了新生儿尿液/唾液中CMV DNA载量变化，发现其尿液/唾液中CMV DNA载量在出生后1个月、3个月、6个月均呈阳性，CMV DNA载量有下降趋势，但是整体变化差异无统计学意义，说明母乳喂养不增加CMV阳性无症状新生儿CMV DNA载量，分析原因，主要为患儿出生时CMV病毒已经在体内存在和增殖，母乳喂养并不能引起感染加重和临床症状严重。人工喂养患儿尿液/唾液中CMV DNA载量在出生后1个月、3个月、6个月并无出现明显下降，与人工喂养患儿比较，母乳喂养患儿CMV DNA载量无统计学差异，说明喂养方式尚不对CMV DNA载量构成影响。与张琳等[7]报道结果一致。

本研究通过随访观察母乳喂养对CMV阳性无症状新生儿发育的影响，发现观察组患儿听力异常2例，但与对照组比较无明显差异，说明母乳喂养并不增加患儿听力损害风险。观察组出现1例丙氨酸氨基转移酶升高，说明母乳喂养可能增加肝功能损害，具体原因不明，因此该结论尚待纳入更多样本加以证实。研究显示CMV感染可引起脑室周围钙化、脑发育不全和实质坏死[8]，木研究两组头颅B超均未发现脑室周围钙化和脑坏死，提示母乳喂养不引起CMV病毒载量增多，进而不影响神经系统正常发育。出现上述结果原因可能与本研究随访时间过短有关，也有可能头颅B超对脑实质病变敏感度低导致。本研究两组贫血检出率比较差异无统计学意义，观察组1例中性粒细胞降低因呼吸道感染导致，因此尚不认为母乳喂养可导致CMV的继发感染。

CMV感染是导致感音性神经性耳聋的危险因素，CMV感染可通过损伤上皮细胞，引起内耳炎症反应导致患儿远期发生感音性神经性耳聋。随着患儿生长发育感音性神经性耳聋症状可能逐渐加重，因此对无症状CMV感染患儿应密切随访，定期进行听力筛查[9-10]。本研究对两组患儿出生3 d、1个月、3个月、6个月分别进行听力筛查，结果两组听力异常率比较差异无统计学意义，可能与随访时间过短有关，也可能与目前听力筛查技术受耳蜗毛细胞功能影响较大，导致假阴性率低有关。脑干听力诱导电位检查对感音性神经性耳聋更具敏感性[11]，因此对CMV阳性患儿定期进行脑干听力诱导电位检查至青春期很有必要。总之目前尚不确定母乳喂养对CMV感染无症状患儿听力是否产生影响，需要长时间随访加以证实。

综上所述，本研究通过观察母乳喂养和人工喂养对CMV阳性患儿唾液/尿液CMV DNA载量的影响，发现乳汁CMV阳性母乳喂养并不增加无症状CMV感染新生儿CMV病毒载量，亦不增加新生儿CMV继发感染风险，母乳喂养对CMV感染患儿大脑发育、感音性神经性耳聋影响尚待延长随访、提高检测手段敏感性加以证实。