聚-谷氨酸促进柑橘苗木生长和矿物元素吸收的研究

宗琪，张生才，范国泰，黄奕，胡党振，姜玲*

（1.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北，武汉 430070；2.国家现代化产业技术体系，福建永春芦柑综合试验站，福建泉州 362600；3.华中农业大学园艺林学学院，国家果树脱毒种质资源室内保存中心，农业部华中地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，湖北武汉 430070）

近几年，PGA 在农业生产上也不断被开发利用，由于PGA 具有生物可降解性和高吸水性，可以将其应用在沙漠和缺水地区。将PGA 制作成种子包衣材料，种植在沙漠及缺水地区，可以快速发芽。在施用肥料和农药时，加入适量的PGA，可以延长药剂的作用时间[2]。PGA 还具有良好的生物降解性，在体内环境下，因酶的生物作用可进一步降解，在自然环境中受微生物的作用也可以降解，具有很好的生物相容性，并且无自身抗原性、可食无毒等优点[3]。PGA 可作为土壤保水剂、肥料增效剂使用，能增强土壤的持水能力，提高肥料的利用率[4]。PGA 在粮食作物和园艺植物如烟草[5]、油菜[6]、水稻[7]、冬小麦[8]、玉米[9-10]、小青菜[11]、葡萄[12]等上的应用已有不少报道，研究发现PGA 可以提高产量、改善品质。迄今为止，PGA 在柑橘苗木上的作用效果还未见报道。为了适应柑橘产业可持续发展的需要，提高柑橘苗木质量，本研究以柑橘实生苗和嫁接苗为试材，采用PGA 单独处理、PGA 与磷酸二氢钾和尿素组合处理两种方案，观察了柑橘的多项生长、生理指标，并对叶片中的矿物元素含量进行了检测分析，从而为PGA 在柑橘良种繁育上的应用提供理论依据和技术方面的指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为强德勒柚实生苗、永春芦柑嫁接苗。

PGA 由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室提供。丙酮、乙醇、盐酸、硝酸等均为优级纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BS210S 万分之一电子天平，北京SARTORIUS 有限公司；AUW120D 分析天平，沈阳天平仪器有限公司；DHG-9076A 电热恒温鼓风干燥箱；KQ-500DV 数控超声波清洗器；电感耦合等离子体发射光谱仪，安捷伦5100；分光光度计，上海仪器科技有限公司；游标卡尺，北瑞科信北京智能科技有限公司。

1.3 田间试验设计

1.3.1 强德勒柚实生苗

试验在华中农业大学国家果树脱毒种质资源室内保存中心进行。利用强德勒柚新鲜果实，取出种子，去果胶，常规消毒，用自来水洗净，将种子分成4组，分别用50、100、200 mg/L PGA 溶液和清水（对照）浸泡12 h，剥去外种皮和内种皮，每钵播种5 粒种子，每个处理种10 个培养钵，基质为蛭石。成苗后供后续生长、生理指标测试用。

1.3.2 芦柑嫁接苗

试验地点在福建省永春绿源柑橘苗木繁育厂1 号育苗网室，于2017 年3 月8 日进行第一次处理，4 月6日第二次处理，5 月6 日第三次处理，7 月10 日观察统计数据。

试验分两组：第一组2 个处理（A1、B1）和1 个对照（C1）。A1 处理：100 mg/L PGA 灌根，每株200 mL；B1 处理：200 mg/L PGA 灌根，每株200 mL；对照组C1：清水灌根，每株200 mL。第二组2 个处理（A2、B2）和一个对照（C2）。A2 处理：100 mg/L PGA+0.2%KH2PO4+0.2%尿素（Urea）喷施叶面，每株200 mL；B2 处理：200 mg/L PGA+0.2%KH2PO4+0.2%Urea 喷施叶面，每株200 mL；对照组C2：清水喷施叶面，每株200 mL。

每个处理均为60 株嫁接苗，进行观测和统计分析。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 强德勒柚实生苗生长指标的测定

发芽率采用直接计数法计算。根长和株高测定是将35 d 的幼苗整株从蛭石中取出，用清水洗净根部基质，用直尺测量，测定10 个生物学重复。用天平分别称量地上部分鲜质量和根鲜质量，测定5 个生物学重复，按文献[13]计算根冠比。按文献[14]测定叶面积，观察8 个生物学重复。

1.4.2 强德勒柚实生苗叶绿素含量的测定

根据文献[13]测定叶绿素的含量。从生长35 d 的植株上采样，取新鲜叶片，去掉中脉，剪碎，称取样品0.5 g，分别放入研钵中，加12 mL 95%乙醇和少量石英砂，研成均浆至组织变白，静置5 min。把提取液倒入漏斗中，过滤到25 mL 容量瓶中，用95%乙醇冲洗残渣数次，并定容至25 mL，在波长665、649 nm 下分别测定吸光度A，分组准确记录，每个处理测定3 个生物学重复。按照公式（1）（2）计算叶绿素a、b 的含量，根据式（3）进一步求出叶绿素的含量。

1.4.3 强德勒柚实生苗可溶性蛋白含量的测定

可溶性蛋白质的测定采用考马斯亮蓝G-250 法（Bradford 法）进行。

制作标准曲线：利用1 000 滋g/mL 的BSA 标准蛋白溶液，根据文献[15]制作标准曲线。称取新鲜柑橘叶片0.5 g/样，加2 mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6 mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温下放置1 h 后过滤于10 mL 带塞的试管中，定容至刻度，即得待测样品提取液。每个处理重复3 次。

蛋白质含量的测定：先取10 mL 带塞试管，分别吸取待测样品0.1 mL，各加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，在595 nm 波长下比色，并通过标准曲线计算样品中可溶性蛋白质的含量[15]，每个处理设3 个重复。

1.4.4 芦柑嫁接苗矿物元素的检测方法

永春芦柑嫁接苗的灰化提取方法是将叶片放入105 益的烘箱中杀酶30 min，再65 益烘干。将叶片磨碎成粉末，用坩埚精确称取0.500 0 g 样品，作好标记，将称量好的样品放进马弗炉中，设置温度为550 益，待马弗炉的温度升到550 益，灰化5 h，然后关闭马弗炉，冷却后取出样品；将灰化好的样品按次序摆好，用移液枪吸取10 mL的溶液（60%H2O+30%HCl+10%HNO3），放进坩埚，提取时间为30 min；将提取液倒进漏斗中过滤，将过滤好的溶液稀释3 倍，然后用ICP-OES 电感耦合等离子体发射光谱仪进行检测。

2 结果与分析

2.1 PGA 对柚实生苗生长的影响

经过35 d 的温室培养，对PGA 处理后柚种子萌发和幼苗生长状况进行观察，结果表明：对照和处理的种子发芽率均为100%。孕郧粤处理对柚苗生长的影响见表1，由表1 可知，50、100、200 mg/L 的PGA 处理柚种子后，其幼苗根长比对照分别提高3.1%、4.8%和9.7%，株高比对照分别提高了6.3%、2.2%和0.9%。PGA 浓度为100 mg/L时，根鲜质量显著高于对照和200 mg/L PGA 处理的苗。PGA 浓度为100 mg/L 时，根冠比高于200 mg/L PGA 处理的。三种浓度PGA 处理的叶面积比对照的叶面积分别增大14.7%、20.6%和16.6%，差异均达到显著水平。上述数据说明PGA 有促进实生苗营养生长的作用，为提高柑橘实生苗的光合作用效率奠定了基础，其中100 mg/L PGA 处理效果较好。

2.2 PGA 对柚苗叶绿素和可溶性蛋白含量的影响

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素和捕获光的主要成分。高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b 两种。叶绿素a 和b 仅在吡咯环域上的附加基团上有差异：前者是甲基，后者是甲醛基。叶绿素a 最大吸收光的波长在420～663 nm，叶绿素b 的最大吸收波长范围在460～645 nm。本试验测定了叶绿素a 和叶绿素b 含量，结果见表2。由表2 可知，100、200 mg/L PGA 处理柚苗后，叶绿素a 含量均显著高于50 mg/L PGA 处理和对照的。PGA 浓度为200 mg/L 时，叶绿素a含量达到最大，叶绿素遭含量没有明显变化。

表1 聚-谷氨酸处理对柚苗生长的影响Table 1 Effect on seedling growth by poly-glutamic acid treatment in pomelo

表1 聚-谷氨酸处理对柚苗生长的影响Table 1 Effect on seedling growth by poly-glutamic acid treatment in pomelo

注：不同小写字母表示相互间差异显著（）。

可溶性蛋白是重要的渗透调节物质和营养物质，它们的增加和积累能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用，也经常用作筛选抗性的指标之一。实验表明：可溶性蛋白的线性回归方程为说明吸光度与可溶性蛋白浓度呈现良好的线性关系。由表2 可知，当100、200 mg/L PGA 处理苗木后，可溶性蛋白含量均极显著地高于对照样品。100 mg/L PGA 处理后，可溶性蛋白达到最高值。

表2 PGA 对叶绿素和可溶性蛋白含量影响Table 2 Effect of PGA on chlorophyll and soluble protein content(

表2 PGA 对叶绿素和可溶性蛋白含量影响Table 2 Effect of PGA on chlorophyll and soluble protein content(

注：不同小写字母表示差异显著，不同大写字母表示差异极显著（

2.3 PGA 对柑橘嫁接苗多项生长指标的影响

在第一组试验中，A1 和B1 处理与对照相比，嫁接苗根数分别增加40.5%和8.1%，根长分别增加8.1%和23.3%，差异均不显著（图1A 和1B）。对植株高度进行比较，B1 处理与对照的差异达到显著水平，A1 与B1 处理差异达到显著水平（（图1C）。对植株冠径进行比较，可知A1 和B1 处理与对照的差异均达到显著水平，A1 与B1 处理的差异不显著（图1阅）。对干径进行比较，可知A1 和B1 处理与对照的差异均达到显著水平，但A1 与B1 处理的差异不显著，两种浓度的PGA 都能显著增加植株的粗度（图1耘），使植株更为健壮。

在喷施PGA、KH2PO4和Urea 的第二组试验中，A2和B2 处理后，与对照相比，根数分别增加17.3%和15.3%，根长分别增加17.3%和4.6%，A2、B2 和对照的差异均未达到显著水平（图1云和1郧）。处理和对照的株高差异也未达到显著水平（图1匀）；冠径比较，A2 和B2 处理与对照的差异均达到显著水平（图1陨）；对干径进行比较，A2 和B2 处理与对照的差异均达到显著水平，但A2 处理与B2 处理差异不显著（图1允），可见，不同浓度的PGA 与0.2%KH2PO4和0.2%Urea 配合均能增加树干粗度，PGA 处理对嫁接苗地上部分的促进生长比地下部分更明显。

2.4 PGA 对柑橘叶片中P、Na 和Zn 元素含量的影响

磷是植物必需的大量元素之一，在生物遗传信息和能量传递中起极其重要的作用。钠是植物生长所必需的营养元素，植物缺钠后会出现黄化病。锌在植物体内主要是作为酶的金属活化剂。本研究对永春芦柑苗木中的大量和微量元素进行了分析，如表所示。

表3 PGA 处理柑橘嫁接苗后叶片中大量和微量元素含量（mg/L）Table 3 Macroelements and microelements contents in leaves after PGA treatment(mg/L)

3 讨论

试验证明PGA 能提高柚实生苗根的鲜质量和叶面积，可增加叶片的叶绿素a 和可溶性蛋白含量，有助于嫁接苗株高、冠径和干径的增加。在光合作用中，绝大部分叶绿素的作用是吸收及传递光能，仅极少数叶绿素a 分子起转换光能的作用，它们在活体中是与蛋白质结合在一起，存在于类囊体膜上。提高叶绿素a 含量有利于提高光合作用效率[16]。可溶性蛋白是重要的渗透调节物质和营养物质，它们的增加和积累能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用，经常用作筛选抗性的指标之一。可溶蛋白质含量的提高，还会增加细胞渗透浓度和功能蛋白的数量，有助于维持细胞正常代谢[17]。可见PGA 能加强光合作用和促进生长指标的改善，提高细胞的代谢功能。

PGA 还可提高磷元素的利用率。磷是矿质元素，吸收动力靠蒸腾作用，它又是一种无机盐，无机盐需要与水一起进入植物的体内，植物是靠根尖成熟区吸收的。当植物体外的无机盐浓度大于植物成熟区细胞的细胞液浓度时，植物体就会从外界吸收无机盐。细胞膜的主动运输需要消耗ATP，主动运输是逆浓度阶梯运输的，由于磷离子较大，要靠细胞膜上蛋白质消耗能量来运输[18]。植物磷营养高效利用通常与根形态、根分泌物、膜与体内磷转运以及菌根等因素有关，表现为受多基因控制。

本试验证明PGA 处理柑橘，能促进实生苗和嫁接苗的根系生长，增加根的数量，这意味着根尖成熟区吸收磷的机会增加。PGA 可以提高磷元素利用率的另一个可能原因是PGA 通过与形成稳定的络合物，从而起到磷肥缓释剂的作用。植物对一些离子的吸收和利用与离子结合常数的大小有关。前人研究报道，PGA 与的结合常数，PGA 与Na+的结合常数由于PGA与离子产生络合作用，可以通过缓效释放过程提高柑橘对P 和Na 的吸收。

大量苗木实地试验证明，PGA 处理对柑橘苗木营养生长的促进作用非常明显。PGA 灌根处理能显著增加株高、冠径和干径。PGA 与KH2PO4、Urea 组合叶面喷施，能提高冠径和干径，PGA 对苗木根系根数和根长有一定的促进作用，但其效果还没有达到显著水平。通过上述两组试验可知，PGA 处理后的苗木叶片增厚，叶色深绿，苗木强壮，这就为苗木后续的生殖生长奠定了基础。PGA 是绿色安全、环保的多肽化合物，能显著提高柑橘嫁接苗的质量。如果这项技术能够广泛地推广和应用，对于提高柑橘苗木质量、发展无病毒良种繁育有非常重要的意义。

然而PGA 在柑橘上使用时，可能含有少量的活菌存在，但主要的作用还在于多肽分子化合物。即使有活菌，即地衣芽孢杆菌的存在，也是起益生菌的作用。但本试验过程中，我们认为起主要作用的还是PGA。PGA 与其它菌肥相比，有其优势。益生菌的作用机制主要包括拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、诱导植物抗性、促进植物生长等，益生菌在田间条件下可能是多种机制共同作用，也可能在植株不同发育时期、不同部位某一机制在起作用，以达到抑制病原的生长、繁殖或杀灭病原的效果。拮抗作用指一种微生物在其生命活动过程中产生的次生代谢物质对其他微生物的活性产生抑制甚至杀灭作用。竞争作用指两种或多种微生物争夺生存空间、位点、营养、水分等，益生菌能在植物体内成为优势菌种，从而限制其它致病菌的生长。植物抗性的产生有两种诱导途径：一是系统获得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR），病原物侵染后，未接种部位诱导出对病原物的抗性；二是诱导系统抗性（Induced systemic resistance，ISR），非病原物刺激植物后，使植物体产生物理或化学屏障，从而增强抗性。益生菌也可通过促进植物生长的作用，从而提高植株抗病性。因此，今后可以对PGA 的作用机制作更深入的探索，从而为PGA 在植物上的应用奠定更坚实的基础。