黄芪和水蛭有效成分对肾小球系膜增生的作用及其机制

李宗国，时召平，张鹏飞

（承德市中医院药学部，河北承德 067000）

肾小球系膜增生是系膜增生性肾小球肾炎的主要病理表现，系膜细胞外基质增多是引起肾小球病变的主要病理机制[1]。有研究显示，细胞外基质金属蛋白酶家族是降解细胞外基质的主要蛋白酶，具有分解基质中明胶及胶原的作用[2]。基质蛋白酶家族中的基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一种IV型胶原酶，能降解细胞外基质（extracellular matrix,ECM）中的变性I型胶原及IV型胶原为主的基膜[3]。核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）可参与细胞内信号传递过程，其转录表达异常可提示间质性肾炎、肾细胞癌等多种肾病[4]。目前，西医治疗系膜增生性肾小球肾炎主要采用激素类药物，但因患者个体差异，临床应用时具有较明显副反应。我国中医根据系膜增生性肾小球肾炎临床症状，将其归为血尿、肾性水肿类疾病，此类疾病因机体气血不通，气机失常，水、气、血运输受阻，形成水肿、淤血，血瘀累积至肾，引起肾间质纤维化等病变。中医认为黄芪具有健脾益气、活血化瘀、保肾养血功效，在治疗肾病时有明显疗效[5]。黄芪主要有效成分包括黄芪多糖、黄芪甲苷、氨基酸、黄酮，其中的多糖成分可作为免疫促进剂，具有抗肿瘤、抗病毒作用，黄芪甲苷在一定浓度内可阻止细胞周期进程。此外，水蛭入药后具有破血逐淤、消痰饮功效，其唾液中有效成分的水蛭素具有较强抑制血栓作用[6]。本研究通过对小鼠肾小球系膜细胞（mouse glomerular mesangial cells，MgCs）应用中药黄芪、水蛭中不同有效成分进行培养，观察两者对系膜细胞增殖及MMP-9、NF-κB水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

昆明种小鼠，体重18～22g，雌性，合格证号：01-3001，购于中国医学科学院实验动物研究所繁育场。小鼠随机分为正常组、模型组、黄芪多糖组、黄芪甲苷组、水蛭素组，每组5只。

1.2 试剂来源

脂多糖（北京索来宝，货号：L8880-10mg）；黄芪多糖（恒瑞康生物科技公司）；水蛭素冻干粉（西安百川生物科技有限公司，货号：XABC-524）；黄芪甲苷溶液（Aladdin公司）；Cell Counting Kit-8试剂盒（北京百奥莱博，货号：YT127）。

1.3 含药血清小鼠模型的制备

小鼠给药剂量参照相关文献提供的实验动物与人临床用药剂量换算公式。各干预组分别给以黄芪多糖、黄芪甲苷、水蛭素4ml/200g/d灌胃，其他组予等剂量生理盐水灌胃，连续5d。于末次给药2h后，取10%水合氯醛腹腔麻醉，在无菌条件下，自颈动脉取血，离心灭菌后，于-70℃低温冷冻保存备用。

1.4 细胞培养

1.4.1 小鼠MgCs的原代培养及鉴定 选取18～22g 健康雌性昆明种小鼠，在无菌条件下取小鼠肾小球毛细血管间的系膜，剥离除去外周结缔组织，刮除内膜，将中膜层组织用预冷的 PBS 冲洗后剪成小块，接种于培养瓶。细胞置于 10% LPS 的 DMEM 低糖培养液中，于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，将接近融合的原代培养细胞消化，按 1∶2 传代。取 4～6 代MgCs用于实验。

1.4.2 筛选LPS促进MgCs增殖的最适条件 调整对数生长期的MgCs细胞数为6×104/cm2接种至96孔板，细胞过夜贴壁后，无血清培养液诱导24h，吸去培养基，加入不同浓度LPS（0%、5%、10%、20%、30%、40%）诱导MgCs增殖，分别培养24、48、72 h。采用CCK8法检测MgCs增殖情况，镜下观察到系膜细胞贴壁生长且呈梭型，表示MgCs增生成功，确定LPS添加浓度为30%。

1.5 预先制备试剂

将10mg脂多糖溶于5ml生理盐水中，制成脂多糖溶液。将0.5g黄芪多糖溶于10ml生理盐水中，制成黄芪多糖溶液。将100ATU水蛭素冻干粉溶于2ml生理盐水，制成水蛭素溶液。黄芪甲苷溶液购自Aladdin公司。

1.6 细胞增殖实验

使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒培养细胞12h后，向黄芪多糖组、黄芪甲苷组、水蛭素组中分别加入500μg/ml黄芪多糖溶液、40μg/ml黄芪甲苷溶液、10μg/ml水蛭素溶液。继续于37℃二氧化碳培养箱中培养，24h后收集细胞。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

将待测细胞制成1×106个/m l的悬液，分别用Annexin V-fluorescein isothiocyanate（FITC）、碘化丙啶（propidiumiodide，PI）避光染色15min。使用流式细胞仪对染色的细胞进行检测。

1.8 实时荧光定量PCR检测基因表达

使用TRIzol试剂从细胞组织中分离总RNA，用M-MLV逆转录酶将总共2μg RNA逆转录成 cDNA，引物序列如下。MMP-9：正向5’- ATCCCTCAACATCGCAACTGT-3’，反向5’-CAGC-CTCTGGTAGATTATCAAGC-3’；NF-κB：正向5’-CCAGATCAATGGCTACAC GG-3’，反向5’-CGCATTCAAGTCATAGTCCC-3’；β-Actin：正向5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，反向5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。使用 SYBR Green PCR Master Mix 在 7500 Fast Real-Time PCR System中，以10μl的终体积进行定量PCR。PCR在以下条件下进行：50℃2min，随后94℃Taq酶活化30s，95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环。以2-ΔΔCt表示基因表达水平。

1.9 免疫细胞化学法检测基因表达

各组细胞药物作用48h后，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton-100通透细胞，3% H2O2去除过氧化物酶，10%山羊血清室温封闭，一抗 4℃湿盒孵育过夜。阴性对照组加PBS代替一抗，生物素化二抗孵育，链霉菌抗生素-过氧化物酶溶液孵育，DAB显色，苏木素复染，封片。采用免疫细胞化学分析法测定MMP-9、NF-κB蛋白表达水平。采用免疫细胞化学分析法测定MMP-9、NF-κB蛋白表达水平，结果如图1和图2所示。

1.10 统计学方法

使用SPSS 23.0软件进行数据分析，正态分布的计量资料多组间比较单因素方差分析，方差不齐的计量资料采用Kruskal-Wallis检验，以（）表示。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪多糖组、黄芪甲苷组及水蛭素组细胞凋亡率增高

经脂多糖诱导增生后，加入黄芪多糖培养的黄芪多糖组、黄芪甲苷组及水蛭素组细胞凋亡率均高于模型组与正常组（P＜0.05），见表1：

表1 各组小鼠凋亡率比较Tab.1 Comparison of apoptosis rate of mice in each group （）

表1 各组小鼠凋亡率比较Tab.1 Comparison of apoptosis rate of mice in each group （）

组别 凋亡率正常组模型组 7.85±0.36% 13.56±0.79%黄芪多糖组 28.74±1.23%黄芪甲苷组 25.31±1.38%水蛭素组 36.25±1.65%F 480.810 P＜0.001

2.2 黄芪多糖组、黄芪甲苷组及水蛭素组细胞MMP-9蛋白表达降低

MMP-9定位于细胞质，各干预组MMP-9蛋白表达均明显低于模型组（P＜0.05），但高于正常组（P＜0.05）；各干预组之间两两比较无显著差异（P＞0.05），见表2：

表2 各组小鼠MMP-9免疫细胞化学结果比较Tab.2 Comparison of immunocytochemical results of MMP-9 in mice of each group

表2 各组小鼠MMP-9免疫细胞化学结果比较Tab.2 Comparison of immunocytochemical results of MMP-9 in mice of each group

注：a.与正常组比较，P＜0.05；b.与模型组比较，P＜0.05

组别 MMP-9（%）正常组 1.53±0.42模型组 65.31±8.84a黄芪多糖组 48.64±3.62ab黄芪甲苷组 47.31±3.28ab水蛭素组 38.47±3.25ab F 143.050 P＜0.001

2.3 黄芪多糖组、黄芪甲苷组及水蛭素组细胞NF-κB蛋白表达降低

NF-κB定位于细胞质，各干预组系膜增生较少，NF-κB蛋白表达均显著低于模型组，但高于正常组（P＜0.05）；各干预组之间两两比较无显著差异（P＞0.05），见表3：

表3 各组小鼠NF-κB免疫细胞化学结果比较Tab.3 Comparison of immunocytochemical results of NFκB in mice of each group

表3 各组小鼠NF-κB免疫细胞化学结果比较Tab.3 Comparison of immunocytochemical results of NFκB in mice of each group

注：a.与正常组比较，P＜0.05；b.与模型组比较，P＜0.05

组别 NF-κB（%）正常组 1.95±0.34模型组 29.18±8.56a黄芪多糖组 17.42±2.15ab黄芪甲苷组 16.78±2.36ab水蛭素组 11.18±1.83ab F 32.100 P＜0.001

2.4 各组小鼠MMP-9 mRNA的PCR检测结果比较

各干预组MMP-9 mRNA明显低于正常组及模型组（P＜0.05）；组内两两比较无显著差异（P＞0.05），见表4：

表4 各组小鼠MMP-9 mRNA PCR检测结果比较Tab.4 Comparison of the results of MMP-9 mRNA PCR in mice of each group

表4 各组小鼠MMP-9 mRNA PCR检测结果比较Tab.4 Comparison of the results of MMP-9 mRNA PCR in mice of each group

注：a.与正常组比较，P＜0.05；b.与模型组比较，P＜0.05

组别 MMP-9正常组 1.00±0.00模型组 8.42±0.91a黄芪多糖组 0.23±0.05ab黄芪甲苷组 0.25±0.03ab水蛭素组 0.14±0.02ab F 385.100 P＜0.001

2.5 各组小鼠NF-κBmRNA PCR检测结果比较

各干预组MMP-9 mRNA明显低于正常组及模型组（P＜0.05）；组内两两比较无显著差异（P＞0.05），见表5：

表5 各组小鼠NF-κBmRNA PCR检测结果比较Tab.5 Comparison of PCR results of NF-κB mRNA in mice of each group

表5 各组小鼠NF-κBmRNA PCR检测结果比较Tab.5 Comparison of PCR results of NF-κB mRNA in mice of each group

注：a.与正常组比较，P＜0.05；b.与模型组比较，P＜0.05

组别 NF-κB正常组 1.00±0.00模型组 2.42±0.19a黄芪多糖组 0.51±0.03ab黄芪甲苷组 0.52±0.04ab水蛭素组 0.34±0.01ab F 479.190 P＜0.001

3 讨论

系膜增生性肾小球肾炎以弥漫性肾小球系膜细胞增生及系膜细胞外基质增多为典型特征[8]。胃肠、呼吸道黏膜感染导致的机体免疫功能降低，是系膜增生性肾小球肾炎的重要病因。患者发病后会逐渐出现肾功能受损、肾间质纤维化、肾小球硬化等病理改变。因机体免疫功能降低，大量炎症因子释放，会加速肾小球损伤进程。同时，炎症因子的释放还可促进NF-κB活化，被激活后的NF-κB亦可诱导炎症因子释放，两者相互促进，使肾脏进一步受损[9]。因此推测，通过调节NF-κB表达水平，可调控系膜增生性肾小球肾炎发展进程。细胞外基质沉积增多是系膜细胞增生的基础病理变化，细胞外基质的合成与降解过程受MMP家族及其组织抑制因子调节[10]。MMP家族中的MMP-9除具有降解细胞外基质作用外，还可分解肾小球基底膜。肾小球基底膜是维持肾脏完整性的重要结构，在肾小球滤过过程中发挥重要作用[11]。因此，MMP-9表达异常可导致肾小球功能及肾脏结构功能受损。

近年来，对中医方法治疗肾病的临床疗效观察已成为研究热点。有研究证实，黄芪、丹参能降低肾小球肾炎患者尿白蛋白、血脂及血浆白蛋白水平[12]。我国中医认为，黄芪性温，归脾肺经，在治疗慢性肾炎、肾病综合征等肾病时有较好疗效。在现代医学对黄芪的研究中发现，黄芪可通过保护红细胞，抑制血小板形成血栓，来改善肾病患者血流动力学表现[13]。另有研究表示，黄芪可通过抑制肾脏生长转化因子表达，达到抑制系膜细胞增生的目的[14]。此外，水蛭作为一味常用于破血、祛瘀、通经的传统中药，在现代医学研究中，发现其含有水蛭素、多台、肝素、抗血栓素等多种物质[15]。其中，水蛭素是水蛭唾液中的一种抗凝血物质，也是一种天然特效凝血酶抑制剂，有强抗血栓作用。同时，水蛭素还能抗炎症因子，清除免疫反应产物，调节免疫功能。

本研究通过体外培养小鼠系膜细胞，经脂多糖诱导增生建立系膜增生性肾小球肾炎模型后，给予不同黄芪及水蛭有效成分继续培养。结果显示，黄芪多糖组、黄芪甲苷组及水蛭素组细胞凋亡率均高于模型组与正常组，说明黄芪多糖、黄芪甲苷及水蛭素均具有促进系膜细胞凋亡的作用。而且，干预组中MMP-9和NF-κB的表达均较模型组显著降低，表明黄芪多糖、黄芪甲苷及水蛭素均可显著抑制系膜细胞的增生。其作用机制可能是通过抑制NF-κB的表达水平，降低炎症细胞因子释放量，从而减轻炎症反应，阻止肾小球硬化或肾间质纤维化发展进程。黄芪及水蛭中各有效成分通过抑制MMP-9表达，避免肾脏基底膜被大量降解，以保护肾脏结构功能。但给予黄芪、水蛭不同有效成分抑制系膜增生后的MMP-9仍高于正常水平，此时升高的MMP-9可降解增多的细胞外基质，进一步抑制系膜增生。

综上所述，黄芪与水蛭作为中医中具有活血化瘀、补气养肾功效的重要药物，在治疗系膜增生性肾小球肾炎时具有较好效果，可于临床使用。但本研究仅检测了NFκB、MMP-9蛋白表达水平，未深入分析其基因与系膜细胞增生关系，笔者将在后续研究中继续探索其对系膜增生的影响机制。