HLB固相萃取技术HPLC法测定地表水中9种酚类化合物

王嘉琦 曹英华 朱琳娜 马立利 魏 炜

(北京市理化分析测试中心,北京 100089)

近年来，社会的发展，带来诸多优势的同时，也带来诸多危害，尤其是水资源污染问题[1，2]，严重影响了人们的身体健康。酚类化合物是环境水中主要污染物之一[3，4]，主要来源于染料、农药、石油化工等企业所排放的废水[5，6]，对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害，是环境检测的重要指标[7]。因此，研究水中酚类化合物的测定方法，监测和控制其含量，有着重要的意义[8，9]。

国内外测定酚类化合物的方法很多[10]。目前，检测水中酚较为常见的有蒸馏法、固相萃取法、液-液萃取法[11]、固相微萃取等预处理方法和4-氨基安替比林法[12，13]、气相色谱法[14]、高效液相色谱法等测定方法[15]。高效液相色谱技术分离效能高、选择性强、检测灵敏、分析速度快，被广泛应用于环境领域。然而传统固相萃取方法对水体中待测物质的富集往往需要大量的水体样品，过滤和富集过程需要较多的时间，富集能力净化效果不高。因此本文选用PRiME HLB固相萃取柱-高效液相色谱法分析测定水体中酚类化合物，减少了水体富集的样品体积，基质效应更低，并且无需吸附剂活化和平衡，缩短了实验室的分析时间，提高了分析效率，适用于水体中9种酚类化合物的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪配PDA二极管阵列检测器(美国Waters公司)；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(美国Agilent公司)；Waters Oasis PRiME HLB固相萃取住6cc(美国Waters公司)。乙腈、乙酸 (色谱级，美国Fisher Scientific公司)；2%乙酸水溶液(2∶98 V/V)：量取490mL一级水，加入10ml乙酸后混匀；盐酸6mol/L (分析纯，南京化学试剂股份有限公司)； 酚类化合物标准品9种 纯度95%以上 (天津阿尔塔科技有限公司)；无水亚硫酸钠 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取苯酚、对硝基酚、4-氯间酚、邻氯酚、邻硝基酚、2，4-二甲酚、2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚和五氯酚标准品10mg溶解于甲醇中，得混合标准储备液1.0mg/mL。

1.3 样品预处理

取待测水样500mL，加入少许无水亚硫酸钠去除余氯。使用溶剂过滤器选取0.45μm微孔滤膜对水样进行过滤。用6mol/L盐酸调节水样PH值至3.0。将全部水样转移至Oasis PRiME HLB固相萃取住，保持流速5mL/min，待柱子近干涸时加入5mL甲醇，将柱子加压使液体排干，收集上述全部流出液。将流出液45°C左右氮气吹至近干，用甲醇定容至1.0mL，经0.22μm微孔滤膜过滤，待HPLC测定。

1.4 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18 4.6x250mm色谱柱，柱温：30°C；流动相：乙腈A+含2%乙酸的水溶液B；梯度：0～5min，40%A+60%B；5～10min，60%A+40%B；10～15min，60%A+40%B；15～20min，80%A+20%B；20～25min，40%A+60%B；流速：0.8mL/min；进样量：10μL；PDA波长：280nm。

9种酚类化合物保留时间见图1。

图1 9种酚类化合物色谱图

2 结果与讨论

2.1 预处理方法的选择

考虑水中可能存在的余氯，对SPE柱吸附水中酚类化合物产生干扰，所以选用无水亚硫酸钠进行余氯的去除。酚类化合物属于弱酸性物质，酸性环境下酚类化合物在水中的溶解度降低，采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形。因为对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在。所以分析酚类等弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸。另外色谱柱都有一定的耐受范围，在流动相的配制过程和使用过程中不能超过色谱柱的耐受范围，否则会损害色谱柱。ZORBAX SB-C18色谱柱的使用pH范围为2.0～11.5，考虑到对色谱柱的保护以及对峰形的影响，因此用盐酸调节pH值为3.0。

2.2 固相萃取柱的选择

本实验尝试采用SPE固相萃取柱对水样进行净化和富集处理，依次选用以下几种型号固相萃取柱进行实验比较：Bond Elut PPL、Bond Elut Plexa、Oasis PRiME HLB、Oasis MCX。经过实验比较发现，Oasis HLB柱具有更好的水浸润和保留特性，对酸性化合物的选择性更强，并且无需活化，精简了吸附剂的平衡步骤，对样品有出色净化能力。而MCX柱更适合酸性强的化合物，对弱酸性化合物吸附能力较弱。Bond Elut Plexa柱适用于非极性化合物，酚类化合物一般极性较强，不适用于此柱。Bond Elut PPL柱适用于强极性物质，苯酚极性较弱，对9种酚类化合物的适用性不如HLB柱广泛。Oasis PRiME HLB柱富集和净化能力出色，以往的固相萃取柱往往需要1L左右的水样过滤富集，耗费大量时间的人力，而HLB柱选择性更强，6cc规格承载量大，因此最终选用Oasis PRiME HLB作为净化萃取柱。

3 方法学验证

3.1 检出限

本实验以浓度为横坐标，各目标物的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以保留时间定性，外标法定量。按照目标物峰面积信噪比(S/N)等于3时计算，9种酚类化合物的检出限分别为： 0.01μg/mL(苯酚、五氯酚)，0.005μg/mL(对硝基酚、4-氯间酚、邻氯酚、邻硝基酚、2，4-二甲酚、2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚)。

3.2 回收率和精密度

向实际空白水样进行添加回收实验，9种目标物的回收率和精密度结果见表1。

表1 方法学验证指标

3.3 标准曲线和线性方程

本实验以质量浓度为横坐标，各目标物的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以保留时间定性，外标法定量。9种酚类化合物的线性方程见表2，通过下面的计算结果可以发现，各酚类化合物的相关系数 r 均满足0.999 以上，线性系数良好。

表2 9种酚类化合物线性方程及相关系数

4 结语

本实验建立了高效液相色谱法同时测定水质中酚类化合物的分析方法，包含了苯酚、对硝基酚、4-氯间酚、邻氯酚、邻硝基酚、2，4-二甲酚、2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚和五氯酚9种物质。目前国家标准方法对酚类化合物的检测是气相色谱法，本实验通过液相色谱法测定，为实验室提供更多的选择和思路。相较气相色谱法检出限更低，拥有更高的灵敏度；而相比一般高效液相色谱检测方法，需要富集的水样量较低，净化效率更高，Oasis PRiME HLB柱的使用简化了预处理步骤，缩减了预处理时间。此外邻氯酚和邻硝基酚由于结构相似色谱峰难以分离，本试验通过优化实验条件解决了此问题，9种酚类化合物的技术指标和分离效果良好，本方法适用于水质中酚类化合物的测定。