加速溶剂萃取-超高效液相色谱联用同时测定食品纸包装中的两种荧光增白剂

黄金飞 骆立刚 段 然

(浙江省家具与五金研究所，杭州 310013)

白度是衡量食品纸包装产品质量的一项重要指标，在制作过程中，为了抵消原材料中纤维和胶料填料本身的微黄色，人们会在其中加入荧光增白剂来提高纸质包装产品的白度。荧光增白剂广泛应用在纺织、造纸、洗衣粉、肥皂、橡胶、塑料、颜料和油漆等方面[1,2]。食品纸包装行业使用的增白剂主要为三嗪氨基二苯乙烯型增白剂，主要有VBL和APC两种。VBL中文别名荧光增白剂85，名称为4,4’-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2’-二磺酸二钠盐，，CAS号12224-06-5；APC中文别名荧光增白剂220，名称为4,4’-二(4-(二(2-羟基乙基)氨基-6-(4-磺酸苯胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基) 对称二苯代乙烯-2,2’-二磺酸四钠 ， CAS号16470-24-9。

荧光增白剂具有典型的环状共轭结构，极易被人体的消化系统的粘膜组织所吸收。这类物质通过食品纸包迁移到食品中，再被人体消化，会很快进入人体循环后达到各个器官[3,4]。由于其分子结构稳定，不易被分解，长期累积下来，会让细胞发生变异，是潜在的致癌因素。相关研究表明，接触含荧光增白剂的食品包装材料时，人体皮肤可能吸附荧光增白剂的量是0.001～0.03 mg/(kg体重·d)，若接触过量，会增加致癌的风险[5-7]。我国颁布的《食品包装用原纸卫生管理办法》中明确规定禁止添加荧光增白剂等有害助剂[5]。国际上也对荧光增白剂提出了限定要求，如欧洲委员会2009 年2月12 日颁布了《1 号技术文件——预期接触食品的纸和纸板材料及制品生产使用的物质清单》要求26 种二苯乙烯类荧光增白剂迁移量不得检出。意大利卫生部1973 年3 月21 日部长令《预期与食品或个人用品接触包装、容器和用具的卫生控制》规定荧光增白剂的允许添加量(单独或组合使用)不得超过总量的0.3%( 质量百分比，以干基计)[8-10]。

目前国内外对对荧光增白剂的检测方法有白度法、荧光白度法、紫外灯照射法、荧光分光光度法、紫外分光光度法，以及液相色谱荧光法和液相色谱质谱法[11-16]。本实验采用加速溶剂萃取(ASE)和高效液相色谱-二极管阵列(HPLC)联用技术，在不使用离子对试剂的条件下，同时对食品包装材料中的两种荧光增白剂进行定性定量分析，建立检测方法。解决了目前分析样品前处理溶剂消耗量大或回收率低的问题，延长了色谱柱的使用寿命，同时使用在实验室普及率较高的二极管阵列检测器为分析器，快速同时测定两种具有代表性的纸用荧光增白剂，降低了试验成本，具有较好的推广意义。

1 试验部分

1.1 仪器

ASE 350加速溶剂提取仪(ThermoFisher，美国)；10 mL萃取池；Vanquish系列超高效液相色谱系统(ThermoFisher，美国)，配二元高压泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器；变色龙7.2数据处理系统。

1.2 试剂与材料

标准物质VBL，APC购自上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇，乙腈：Fisher公司；N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺：国药集团；水：18.2 MΩ/cm，Millipore公司。

1.3 样品前处理

将样品用剪刀剪成1 cm×1 cm大小的碎片，准确称量1 g，倒入事先垫有纤维过滤膜的10 mL萃取池中。采用ASE提取，定容至25 mL，过0.45 μm滤膜，待HPLC分析。

加速溶剂萃取条件：萃取溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；萃取温度为80℃；静态萃取时间为5min，循环萃取2次；吹扫体积为60%，吹扫时间为120s。

1.4 分析条件

色谱柱：Acclaim 120 C18, 2.1*100 mm, 2.2 μm(ThermoFisher，美国)；柱流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL；柱温：45℃；流动相：流动相A：水；流动相B：乙腈；检测器波长：350nm。流动相：A：5 mM醋酸铵水溶液，B：甲醇，甲醇初始梯度15%, 2min升至35%，最后9min升至65%。色谱图见图1。

图1 APC和VBL色谱图(标准混合溶液浓度10 mg/L，APC和VBL的保留时间分别为4.12和8.09min)

2 结果与讨论

2.1 萃取条件选择

2.1.1ASE萃取溶剂选择

本方法分别采用甲醇、乙腈、水、N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基乙酰胺对餐巾纸中的荧光增白剂加标回收试验。试验结果表明：采用N，N-二甲基甲酰胺能取得最佳萃取效果，VBL和APC两种荧光增白剂的回收率均大于80%。

2.1.2ASE萃取温度选择

本方法分别考察了40℃、60℃、80℃、100℃和120℃对荧光增白剂萃取效率的影响。实验结果表明：随着萃取温度的增加，VBL和APC的萃取率随之增加，80℃达到最佳；当温度大于80℃的时候，萃取率下降。综合实验结果，本方法选择80℃作为后续的萃取温度。

2.1.3ASE萃取循环次数选择

本实验以5min作为静态萃取时间，考察循环次数对两种荧光增白剂萃取率的影响。参考1.3部分进行试验，称取1g样品，设置萃取循环次数为1次。对该样品连续萃取3次，分别收集萃取液，定容至25mL。采用UHPLC测试3个萃取液中VBL和APC的含量。实验结果表明：第1次循环对VBL、APC的萃取量占总萃取量的96.1%，96.4%；第2次循环对VBL、APC的萃取量只占总萃取量的3.6%，3.5%；第3次循环对3种荧光增白剂的基本未检出。综合实验结果，本方法选择两次循环。

最终ASE方法采用N，N-二甲基甲酰胺作为萃取溶剂，萃取温度80℃，静态萃取时间5min，循环2次。

2.2 紫外波长选择

通过二极管阵列检测器(DAD)在300～400 nm波长范围内进行扫描，确认APC和VBL的最大吸收波长分别为350和348.9 nm，考虑检测方便性，以及VBL在350和348.9 nm处响应差别很小，故方法统一选择350 nm作为检测波长(图2)。

图2 APC和VBL最大吸收波长二极管阵列检测器扫描

2.3 色谱柱选择

考察4种不同类型得到色谱柱对两种荧光增白剂的分离效果。包括Hypersil Gold Vanuqish aQ (2.1*100 mm，1.9 μm，极性封端的C18固定相)，Acclaim 120 C18(2.1*100 mm，2.2μm，高载样量的通用型C18固定相) ，Acclaim C8 (2.1*100 mm，3.0 um，高载样量的通用型C8固定相)和Acclaim PAII(2.1*100 mm，2.2 μm，C18内嵌酰胺基团的交叉键合固定相)。发现四款色谱柱对两种荧光增白剂均有较好的分离效果，其中APC结构中有更多的磺酸基团，极性相对VBL更强，因此在C18上保留较弱。综合比较峰形、分离度等因素，以及考虑方法通用性，选择Acclaim 120 C18色谱柱作为方法优选色谱柱。

2.4 流动相选择

有机相方面：选择常用的甲醇和乙腈两种有机相进行比较，发现乙腈对荧光增白剂的洗脱能力较强，尤其是APC在乙腈作为有机相时在色谱柱上基本无保留，而同样条件下甲醇作为有机相时，两种荧光增白剂在柱子上均有较好的保留，峰形、分离度均较为理想，故最终选择甲醇作为有机相。

流动相添加剂选择：比较了水-甲醇、乙酸铵-甲醇和乙酸-甲醇体系下两种荧光增白剂的分离效果。使用5 mM乙酸铵水溶液-甲醇体系时，相对于纯水相，可以增强待测物和固定相的相互作用，而当使用乙酸水体系时，由于在低pH条件下APC和VBL结构中磺酸根更多以磺酸形式存在，反相作用增强，使得两种荧光增白剂在柱子上保留增强。在水-甲醇体系下峰形差，使用0.1%乙酸水溶液-甲醇体系时，分离度差，两种体系均不适合。在5 mM乙酸铵水溶液-甲醇体系下能兼顾待测物保留、峰形和分离度，故最终选择5 mM乙酸铵水溶液-甲醇体系。

最终UHPLC条件为Acclaim 120 C18为色谱柱，采用5 mM乙酸铵水溶液-甲醇体系进行分离，在12min之内完成两种荧光增白剂的分析检测。在色谱柱分离萃取液的过程中，不使用离子对试剂条件下的分析参数，解决了色谱柱固定相与离子对试剂结合而减少寿命的问题[11,12]；在检测器端，采用了使用较为广泛的二极阵列管检测器来进行分析，解决了荧光检测器适用范围较窄，质谱检测器较为复杂昂贵的问题[4, 11, 14,15]。

2.5 方法学数据

分别配制0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0和20.0 mg/L的2种荧光增白剂混合标准溶液。考察仪器线性。实验结果表明两种组分在0.05～20.0 mg/L此区间线性关系良好，线性相关系数均大于0.9998(见表1)。以3倍信噪比(S/N)计算各组分检出限，结果样品前处理过程，VBL和APC检出限分别为0.036和0.06 mg/kg。同时对0.1 mg/L标准溶液连续6针，考察仪器稳定性，仪器RSD分别为1.2%和0.8%之间，仪器稳定性满足要求。

采用1.0、5.0、10.0 mg/kg 3个加标水平，分别考察该方法的加标回收率。实验结果表明，1.0～10.0 mg/kg的加标情况下，加标回收率范围为83.7～95.8%，满足分析检测要求，见表1。

表1 检出限、线性、加标回收率及RSD

2.6 样品分析

于市场上选择3品类包装纸，采用本方法进行分析检测。将样品用剪刀剪成1 cm×1 cm大小的碎片，准确称量1g，倒入事先垫有纤维过滤膜的10 mL萃取池中。采用ASE提取，定容至25 mL，过0.45 μm滤膜，待HPLC分析。实验结果表明：各种包装纸中均含不同程度的荧光增白剂，需要有关部门的监督管理，避免各类荧光增白剂危害消费者的安全(表2、图3)。

图3 样品及样品加标色谱图(加标量为1.0 mg/kg)

表2 样品分析结果 mg/kg

3 结论

采用加速溶剂萃取-液相色谱法(ASE-HPLC)测定食品包装材料中的APC和VBL 2种荧光增白剂。实验优化了ASE前处理条件，在以萃取溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；萃取温度为80℃；静态萃取时间为5min，循环萃取2次时，能达到最佳萃取状态，整个样品前处理只需要20min即可完成，无须经过繁琐的人工前处理过程，不仅时间消耗少，试剂消耗量少，并且操作简单，回收率高。结合超高效液相色谱法，本方法采用常见的甲醇和缓冲盐作为流动相，摒弃了文献报道的离子对色谱法，简化了液相色谱方法，提高液相色谱柱的使用寿命。同时兼具仪器灵敏度高，稳定性好，分析速度快等特点。本方法是食品纸包装材料中荧光增白剂测定的快捷有效的方法。