1例副鸡禽杆菌和鼻气管鸟杆菌混合感染的诊断

梅 晨，王琪琎，先 宏，张 雪，胡 伟，王宏俊

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 海淀 100097)

2019年3月，北京某蛋鸡养殖场出现大量以流鼻涕、打喷嚏、面部肿胀和食欲下降等为主要症状的鸡只，并且在鸡群中呈现蔓延趋势，初步怀疑为鸡传染性鼻炎。为确诊病因，本试验进行了病原菌的分离鉴定。在此过程中，我们同时分离到副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)和禽鼻气管鸟杆菌(Omithobacteriumrhinotracheale，ORT)。报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 参考菌株和阳性血清 副鸡禽杆菌、禽鼻气管鸟杆菌标准菌株及副鸡禽杆菌阳性鸡血清，均由本研究室保存；禽鼻气管鸟杆菌阳性分型血清由中国农业大学何诚教授惠赠。

1.1.2 病料 具有呼吸道症状病鸡的鸡头，130日龄，来自北京某蛋鸡养殖场。

1.1.3 主要试剂 TSA、TSB培养，均基购自BD公司；2×TaqPCR Mix，购自Genestar公司；16S rRNA引物，由深圳华大基因科技服务有限公司合成；药敏纸片，购自OXOID公司。

1.1.4 主要仪器 168-1000XC酶标仪，为美国 BIO-RAD公司产品；DYY-6D电泳仪，为北京六一仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 副鸡禽杆菌与鼻气管鸟杆菌的分离 75%酒精对送检鸡头表面皮肤进行消毒处理。眶下窦部位烙铁烧烫后，用灭菌处理的手术刀片划开，用无菌长棉签沾取眶下窦中干酪样物质，均匀划线涂在含有5%鸡血清的TSA平板中，将平板置于烛缸，37 ℃厌氧培养24 h。次日，挑取单个代表性菌落进行传代，连续传代3次，直至长出大小形态均一的菌落。将分离到的菌落形态完全不同的2种细菌分别以适当浓度涂于载玻片上，进行固定与革兰染色，在光学显微镜下观察细菌的染色和形态特征。

1.2.2 2种分离菌的DNA提取及16S rRNA测序与比对 将纯化后的副鸡禽杆菌与鼻气管鸟杆菌分别加入含10%血清及50 μg/mL NAD的TSB培养基培养过夜，参照天根生化科技(北京)有限公司DNA细菌提取试剂盒操作步骤，提取细菌DNA并测定浓度。参考陈小玲等[1]设计的细菌16S rRNA上下游引物序列，对2株分离菌进行PCR，反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小，并送华大基因科技服务有限公司进行16S rRNA测序，将测序后的基因序列与NCBI上传序列进行比对。

1.2.3 2种分离菌的药敏试验 参考文献[2]中的操作步骤，应用药敏纸片扩散法对分离的副鸡禽杆菌和鼻气管鸟杆菌菌株进行药物敏感性试验。

1.2.4 血凝抑制试验检测副鸡禽杆菌血清型 参照Page等[3-4]建立的HA-HI试验步骤，将副鸡禽杆菌分离株在96孔微量凝集板中用灭菌PBS进行倍比稀释，并设阴性对照。然后每孔加入等体积的1%鸡红细胞悬液，轻微震荡混匀后放37 ℃恒温箱20 min，观察并计算血凝效价HA。将实验室制备的抗副鸡禽杆菌高价血清,按照不同血清型用灭菌PBS进行倍比稀释，每孔25 μL，设置阴性对照孔及阳性对照孔。除阴性对照孔外，每孔加入25 μL的4 HA抗原，作用30 min后，每孔加入25 μL的1%鸡红细胞悬液，轻微震荡混匀后放37 ℃恒温箱20 min，观察试验结果。

1.2.5 禽鼻气管鸟杆菌抗原制备与琼脂糖扩散试验 将禽鼻气管鸟杆菌分离株和标准株接种于5%鸡血清TSA平板中，37 ℃温箱培养48 h，用1 mL含有8.5%氯化钠，0.3%福尔马林的PBS将菌落洗下，放入2 mL EP管中，将菌液调整至OD600值为0.5～0.6，沸水浴煮60 min，菌液冷却后15 000 g离心30 min，取上清，即为试验所用抗原。梅花桩打孔1.5%琼脂糖平板，将阳性分型血清25 μL加入中央孔，外周孔分别加入25 μL不同阳性抗原及待测抗原，同时设立阴性血清对照，倒置放入37 ℃温箱中培养，每24 h观察1次沉淀线，连续观察至第3天，并记录结果。

1.2.6 分离菌攻毒试验 试验分为4组，每组10只鸡。第1组为副鸡禽杆菌攻毒组，挑取单菌落划线TSA培养板，37 ℃培养15 h，次日用灭菌PBS洗下菌落，调至浓度为106CFU/mL，每只鸡眶下窦接种0.2 mL；第2组为禽鼻气管鸟杆菌攻毒组，细菌培养方法同上，调整菌液浓度为109CFU/mL，每只鸡眶下窦接种0.2 mL；第3组为副鸡禽杆菌攻毒与禽鼻气管鸟杆菌共感染组，将副鸡禽杆菌按106CFU/mL浓度每只接种0.2 mL后，再将禽鼻气管鸟杆菌按109CFU/mL浓度每只接种0.2 mL；第4组为阴性对照组，每只鸡眶下窦接种0.2 mL灭菌PBS。

2 结果

2.1 2种分离株16S rRNA测序与比对 对分离到的副鸡禽杆菌与禽鼻气管鸟杆菌进行革兰染色，油镜下观察均为革兰阴性多形性短杆菌(见中插彩版图1，图2)。2个分离株进行16S rRNA的PCR，产物进行1%琼脂糖电泳，目的条带大小在1 540 bp左右，与预期相符。将2个分离株测序后与GenBank中已上传序列进行比对，结果显示，2株菌分别为副鸡禽杆菌(DW-1)与禽鼻气管鸟杆菌(ORT-18)。16S rRNA基因测序结果已经分别上传到GenBank中，登录号分别为DW-1：MK855504.1，ORT-18：MN023014.1。

2.2 2种分离株药敏试验 取分离的培养菌按常规纸片法进行药敏试验，结果显示，2株分离菌对强力霉素、青霉素G等敏感，对链霉素及卡那霉素均不敏感，见表1。

2.3 血凝抑制检测副鸡禽杆菌血清型 血凝抑制试验鉴定副鸡禽杆菌分离株的血清型，结果显示，分离株与1 600倍稀释后的A 型标准阳性血清发生阳性反应(表2)，而与B型和C型副鸡禽杆菌的特异性阳性血清没有结合反应，说明此分离株为A型副鸡禽杆菌。

表1 2种细菌分离株的药敏试验结果

表2 副鸡禽杆菌的分型结果

2.4 琼扩试验检测禽鼻气管鸟杆菌血清型 经过72 h湿盒孵育，观察抗原孔与抗体孔中间有无沉淀线产生。结果显示，此次的分离株只与A型阳性血清产生沉淀线，因此判定分离的禽鼻气管鸟杆菌血清型为A型。

2.5 动物回归试验 副鸡禽杆菌攻毒组的10只试验鸡，在攻毒后24 h均出现呼吸道症状，表现出流鼻涕、打喷嚏、甩头，头面部出现一侧或双侧肿胀。禽鼻气管鸟杆菌攻毒组中，3只试验鸡表现为流鼻液、呼吸有湿啰音等呼吸道症状。病鸡剖检可见气囊炎、单侧或双侧纤维素性化脓性肺炎。共感染组中，10只试验鸡都出现严重的面部肿胀及大量鼻涕，并有眼睑及结膜炎症状，双眼因肿胀而闭合，病鸡均出现精神委靡，羽毛松乱。痊愈时间滞后2～3 d。 试验鸡病原菌重分离并进行16S rRNA测序鉴定，结果显示，共感染组的试验鸡能够分离到副鸡禽杆菌和禽鼻气管鸟杆菌。

3 讨论

引起鸡只眼睑肿胀的病原有多种，最常见的是副鸡禽杆菌引起的鸡传染性鼻炎。该病可引起严重的鸡上呼吸道疾病[5-6]。临床表现为打喷嚏、流鼻涕、鼻窦炎、结膜炎以及面部肿胀等，造成产蛋鸡产蛋率下降，肉鸡淘汰率明显升高，给养禽业造成很大经济损失[7-8]。如果控制不及时，易与其他疾病继发感染[9-11]。目前，许多鸡场仍倾向于用抗生素控制鸡传染性鼻炎等细菌性传染病。在生物安全条件较差的养鸡场，鸡舍通风不良导致舍内氨气、硫化氢等刺激性气体超标，呼吸道黏膜受损，使得呼吸道传染性疾病发生率大幅提高。

禽鼻气管鸟杆菌病呈全球范围内流行，易感动物种类繁多，尤以禽类最为易感。主要临床症状为流鼻涕，呼吸紊乱等呼吸道症状，病鸡生长迟缓，采食量及肉增重减少，蛋鸡产蛋量降低等。临床剖检中，病鸡多见气囊炎、单侧或双侧纤维素性化脓性肺炎、胸膜炎等。该菌常与其他细菌或病毒混合感染家禽[12-14]，有文献报道，在秘鲁发生了副鸡禽杆菌与禽鼻气管鸟杆菌的混合感染[15]，本试验首次从国内病例中同时分离到A型副鸡禽杆菌与A型禽鼻气管鸟杆菌。目前，禽鼻气管鸟杆菌病原学、防控技术等研究还不够深入，由于其血清型众多，各分离株对抗生素的敏感性差异显著，并且抗生素大量使用导致该菌耐药性不断增强。有必要深入研究该病原菌的致病机理，进一步探究其防治策略。

药敏试验结果显示，DW-1和ORT-18分离株之间存在差异。实践生产中，可以通过病原菌分离培养、药敏试验筛选共同有效的抗菌药治疗不同病原菌混合感染的病例。随着抗生素禁用和限用等法律法规的不断出台，单纯应用抗生素治疗细菌感染已经越来越不可取，有效预防才是关键。因此，开发具有更高免疫保护效力的针对性疫苗是选项之一，应考虑针对感染症状相似但病原菌不同的细菌病开发联合疫苗。