不同品种及采收期党参药材中5种有效成分含量的比较研究

刘付松 陈翠莎 孙佩 刘莎 韦中兰 刘小琪 吴发明

中圖分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）14-1677-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.03

摘 要 目的：建立同时测定党参药材中党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ和苍术内酯Ⅲ含量的方法，并比较不同品种及采收期党参药材中上述5种成分的含量。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）。色谱柱为Inertsil ODS-3，流动相为乙腈-水（梯度洗脱），检测波长为210 nm（党参炔苷）、220 nm（苍术内酯Ⅱ、苍术内酯Ⅲ、丁香苷）、276 nm（苍术内酯Ⅰ），流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。结果：党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ和苍术内酯Ⅲ检测质量浓度的线性范围为44.30～886.00 μg/mL（r=0.999 7）、6.50～130.03 μg/mL（r=0.999 6）、4.47～89.46 μg/mL（r=0.999 5）、2.53～50.50 μg/mL（r=0.999 4）、5.64～112.80 μg/mL（r=0.999 5）;定量限分别为2.446 0、0.168 0、0.248 1、0.065 7、0.099 8 μg/mL，检测限分别为1.352 0、0.067 2、0.005 4、0.006 3、0.007 3 μg/mL;精密度、稳定性（24 h）、重复性、耐用性试验的RSD均小于2%;加样回收率分别为98.87%～100.62%（RSD=0.73%，n=6）、98.46%～101.54%（RSD=1.15%，n=6）、98.32%～101.12%（RSD=1.19%，n=6）、96.83%～104.16%（RSD=2.62%，n=6）、97.87%～100.99%（RSD=1.07%，n=6）。含量分别为33.78～431.82、0～20.60、0.44～3.68、0～10.83、0.27～73.40 μg/g。党参炔苷含量由高到低为党参>川党参>素花党参>洛党参;丁香苷为党参>素花党参>川党参，在洛党参中未检出;苍术内酯Ⅰ为素花党参>洛党参>党参>川党参;苍术内酯Ⅱ为党参>素花党参，在川党参和洛党参中未检出;苍术内酯Ⅲ为党参>素花党参>洛党参>川党参。6～10月采收的党参药材中均以党参炔苷含量最高;6～10月苍术内酯Ⅰ含量均较低;8月苍术内酯Ⅱ未检出;9月苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ含量较低，且丁香苷、苍术内酯Ⅱ在部分样品中未检出。结论：所建HPLC法操作简单、准确、灵敏度高、重复性好，可用于同时测定党参药材中5种有效成分的含量;不同品种及采收期党参药材中5种有效成分含量存在较大差异。

关键词 党参;党参炔苷;丁香苷;苍术内酯Ⅰ;苍术内酯Ⅱ;苍术内酯Ⅲ;高效液相色谱法;品种;采收期;含量测定

Comparative Study on Contents of 5 Active Ingredients in Different Varieties and Harvesting Periods of Codonopsis Radix

LIU Fusong1，CHEN Cuisha1，SUN Pei2，LIU Sha1，WEI Zhonglan1，LIU Xiaoqi1，WU Faming1（1. College of Pharmacy， Zunyi Medical University， Guizhou Zunyi 563003， China; 2. Industrial Crop Research Institute， Sichuan Academy of Agriculture Sciences， Chengdu 610300， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of the contents of codonopatin， syringin， atractylenolide Ⅰ， atractylenolide Ⅱ and atractylenolide Ⅲ， and to compare the contents of above 5 components in different varieties and harvesting periods of Codonopsis Radix. METHODS： HPLC method was used. The column was Inertsil ODS-3 with mobile phase consisted of acetonitrile-water （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelengths were 210 nm （codonopatin）， 220 nm （syringin， atractylenolide Ⅱ， atractylenolide Ⅲ）， 276 nm （atractylenolideⅠ）. The column temperature was set at 30 ℃， and the sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of codonopatin， syringin， atractylenolide Ⅰ， atractylenolide Ⅱ and atractylenolide Ⅲ were 44.30-886.00 μg/mL （r=0.999 7）， 6.50-130.03 μg/mL （r=0.999 6）， 4.47-89.46 μg/mL （r=0.999 5）， 2.53-50.50 μg/mL （r=0.999 4）， 5.64-112.80 μg/mL （r=0.999 5）; the limits of quantification were 2.446 0， 0.168 0， 0.248 1， 0.065 7， 0.099 8 μg/mL， and detection limits were 1.352 0， 0.067 2， 0.005 4， 0.006 3， 0.007 3 μg/mL; RSDs of precision， stability （24 h）， repeatability and durability tests were all less than 2%; the recoveries were 98.87%-100.62% （RSD=0.73%， n=6）， 98.46%-101.54% （RSD=1.15%， n=6）， 98.32%-101.12% （RSD=1.19%， n=6）， 96.83%-104.16% （RSD=2.62%， n=6）， 97.87%-100.99% （RSD=1.07%， n=6）. The average contents were 33.78-431.82，0-20.60，0.44-3.68，0-10.83，0.27-73.40 μg/g. The content of codonopatin was in descending order was as follows as Codonopsis pilosula>C. tangshen>C. pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen>ecotypic variety of C. tangshen. The content of syringin in descending order was C. pilosula>C. pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen>C. tangshen， but it was not detected in ecotypic variety of C. tangshen. The content of atractylenolide Ⅰ in descending order was C. pilosula Nannf. var. modesta （Namf.） L. T. Shen>ecotypic variety of C. tangshen>C. pilosula>C. tangshen. The content of atractylenolide Ⅱ in C. pilosula was higher than C. pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen， but was no detected in C. tangshen and ecotypic variety of C. tangshen. The content of atractylenolide Ⅲ in descending order was C. pilosula>C. pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen>ecotypic variety of C. tangshen>C. tangshen. In Codonopsis Radix collected from Jul. to Oct.， the content of codonopatin was the highest; the content of atractylenolide Ⅰ was lower in sample collected from Jun. to Oct.; atractylenolide Ⅱ was not detected in sample collected in Aug.; the contents of atractylenolide Ⅰ and atractylenolide Ⅱ were the lower in sample collected in Sept.， and syringin and atractylenolide Ⅱ were not detected in some samples. CONCLUSIONS： The established HPLC method is simple， accurate， highly sensitive and reproducible. It can be used to simultaneously determine 5 active ingredients contents of Codonopsis Radix; there are great difference in contents of 5 active ingredients in different varieties and harvesting periods of Codonopsis Radix.

KEYWORDS   Codonopsis Radix; Codonopatin; Syringin; Atractylenolide Ⅰ; Atractylenolide Ⅱ; Atractylenolide Ⅲ; HPLC; Variety; Harvesting period; Content determination

党参（Codonopsis Radix）为桔梗科植物党参[Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]、素花党参[C. pilosula Nannf. var. modesta（Nannf.）L. T. Shen]或川党参[C. tangshen Oliv.]的干燥根[1];洛党参（Ecotypic variety of C. tangshen）为桔梗科植物川党参（C. tangshen Oliv.）生态型变种的干燥根，是党参药材的重要地方栽培品种之一[2]。党参是我国常用的传统补益类中药，味甘、性平，具有补中益气、健脾益肺、除烦止渴之功效，可用于治疗脾肺虚弱、气短心悸、食少便溏、内热消渴等症[1]。该药主要含有糖类、半萜内酯类、聚炔类、苷类及萜类等化学成分[3-6]。现代药理研究表明，党参具有调节血糖、促进造血功能、抗缺氧、抗应激、抗疲劳、增强机体免疫力、延缓衰老、调节胃收缩、保护胃肠道黏膜及抗溃疡等作用[7-9]。聚炔类成分党参炔苷为党参的指标性成分，常用于评价党参质量[10];苷类成分丁香苷具有一定的体内外抗肿瘤活性[11];半萜内酯类成分苍术内酯Ⅰ～Ⅲ为党参的特征性成分，具有明显的抗炎活性[12]。

党参营养丰富、应用广泛，具有极大的食用和药用价值[13]。但因无序采挖，其野生资源面临枯竭，目前市场上流通的党参多为人工栽培品种[14]。有研究表明，由于基原、产地、采收期的不同以及栽培、产地加工的不规范，使得党参药材中各种有效成分的含量存在较大差异，从而导致其质量受到严重影响[15-19]。2015年版《中国药典》（一部）仅对党参进行了定性鉴别[1]，且方法简单，无法满足现代产业发展的质量控制要求。虽然，有学者对党参中有效成分的含量进行了检测[10-12]，但指标较少。根据中医理论，中药药效的发挥是多种成分共同作用的结果，其含量高低将直接影响中药疗效，因此仅以2～3种有效成分为指标并不能全面反映党参的整体质量[20-21]。为此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定了不同品种及采收期党参药材中党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ和苍术内酯Ⅲ的含量，旨在为其质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括二元泵、自动进样器、二极管阵列紫外检测器（美国 Agilent 公司）;ME-204E型万分之一电子分析天平、XPE-26型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）;SK250H型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）;Milli-Q Advantage A10 型超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂

丁香苷对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq16060805，纯度：98.00%）;党参炔苷对照品（批号：MUST-16062207，纯度：98.88%）、苍术内酯Ⅰ对照品（批号：MUST-17030201，纯度：99.99%）、苍术内酯Ⅱ对照品（批号：MUST-17030202，纯度：99.99%）、苍术内酯Ⅲ对照品（批号：MUST-16032203，纯度：99.99%）均由成都曼斯特生物科技有限公司提供;甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

25批党参药材（编号：DS1～DS19、SH1～SH2、CD1～CD2、LD1～LD2）经遵义医科大学药学院姚秋阳副教授鉴定，分别为桔梗科植物党参[C. pilosula（Franch.）Nannf.）]、素花党参[C. pilosula Nannf. var. modesta（Nannf.）L. T. Shen]、川党参（C. tangshen Oliv.）以及栽培品种洛党参（Ecotypic variety of C. tangshen）的干燥根。党参药材来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～3 min，3.5%A;3～20 min，3.5%A→14%A;20～35 min，14%A→23%A;35～60 min，23%A→72%A;60～76 min，72%A→95%A）;检测波长：210 nm（党参炔苷）、220 nm（苍术内酯Ⅱ、苍术内酯Ⅲ、丁香苷）、276 nm（苍术内酯Ⅰ）;流速：0.8 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ、苍术内酯Ⅲ对照品各适量，分别置于5 mL量瓶中，加30%甲醇溶解并稀释至刻度，得各单一对照品贮备液。精密量取上述各单一对照品贮备液适量，置于同一10 mL量瓶中，加30%甲醇稀释至刻度，制得上述5种成分质量浓度分别为886.00、130.03、89.46、50.50、112.80 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取党参药材适量，粉碎。精密称取上述粉末约1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇30 mL，密塞，稱定质量，超声（功率：400 W，频率：50 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用30%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 空白对照溶液 以30%甲醇为空白对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，各成分理论板数按苍术内酯Ⅲ计均不低于3 000，分离度均大于3，空白对照对测定无干扰，详见图1。

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.25、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分别置于5 mL量瓶中，加入30%甲醇稀释并定容，得5个不同质量浓度的系列线性工作溶液，另取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，结果见表2。

2.5 定量限与检测限考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，用甲醇倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ、苍术内酯Ⅲ的定量限分别为2.446 0、0.168 0、0.248 1、0.065 7、0.099 8 μg/mL，检测限分别为1.352 0、0.067 2、0.005 4、0.006 3、0.007 3 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液2.0 mL，置于5 mL量瓶中，加入30%甲醇稀释并定容，制得党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ、苍术内酯Ⅲ质量浓度分别为354.40、52.01、35.78、20.20、45.12 μg/mL的溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，上述5种成分峰面积的RSD分别为0.35%、0.18%、1.03%、0.64%、1.11%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：DS9）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ和苍术内酯Ⅲ峰面积的RSD分别为0.15%、0.29%、1.81%、0.54%、0.21%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取党参药材（编号：DS9）粉碎，精密称取上述粉末适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中5种成分的含量。结果，党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ和苍术内酯Ⅲ的平均含量分别为335.54、11.87、3.01、8.02、24.41 μg/g，RSD分别为0.41%、0.98%、1.15%、0.84%、1.32%（n=6），表明方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的党参药材（编号：DS9）粉末适量，共6份，精密加入已知含量的党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ和苍术内酯Ⅲ各单一对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.10 耐用性试验

取党参药材（编号：DS9）粉碎，精密称取上述粉末适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件分别以不同流速（0.6、0.8、1.0 mL/min）、不同柱温（25、30、35 ℃）进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中5种成分的含量。结果，5种成分含量的RSD均小于3%，表明方法耐用性良好。

2.11 样品含量测定

取25批党参药材粉碎，精密称取上述粉末适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中5种成分的含量。每批样品平行测定3次，结果见表4（表中，“-”表示未检出）。

2.12 不同品种党参药材中5种有效成分含量的动态变化

不同品种党参药材中5种有效成分的含量存在差异。黨参炔苷含量由高到低为党参>川党参>素花党参>洛党参;丁香苷为党参>素花党参>川党参，在洛党参中未检出;苍术内酯Ⅰ为素花党参>洛党参>党参>川党参;苍术内酯Ⅱ为党参>素花党参，在川党参和洛党参中均未检出;苍术内酯Ⅲ为党参>素花党参>洛党参>川党参，详见图2（因党参炔苷含量过大，约为其他成分的20倍，可能会影响整体视图效果，故将该成分含量缩小20倍，缩小后不影响其含量变化趋势）。

2.13 不同采收期党参药材中5种有效成分含量的动态变化

6～10月采收的党参药材中均以党参炔苷含量最高;6～10月苍术内酯Ⅰ含量普遍较低;8月苍术内酯Ⅱ未检出;9月苍术内酯Ⅰ、苍术内酯Ⅱ含量较低，且丁香苷（LD1～LD2）、苍术内酯Ⅱ（SH1、CD1～CD2、LD1～LD2）在部分样品中未检出，详见图3（因党参炔苷含量过大，约为其他成分的15倍，在图中会影响整体视图效果，故将党参炔苷含量缩小15倍，缩小后不影响含量变化趋势）。

3 讨论

本课题组在前期预试验中，对5种待测成分在200～400 nm全波长范围内进行了紫外光谱扫描。结果发现，党参炔苷在210 nm，苍术内酯Ⅱ、苍术内酯Ⅲ、丁香苷在220 nm，苍术内酯Ⅰ在276 nm波长处均有较强吸收，且对应色谱峰峰形、分离度均较好，故选择多波长进行检测。本课题组分别对甲醇-水、乙腈-水等不同流动相体系进行了考察。结果显示，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱时，流动相洗脱能力强，各成分分离效果较好，基线平稳，出峰稳定且峰形尖锐，故选择乙腈-水为流动相。同时，本课题组还对不同提取溶剂（30%甲醇、70%甲醇、甲醇）进行了考察。结果显示，以30%甲醇为提取溶剂时，各成分色谱峰峰面积均高于其他提取溶剂，故选择30%甲醇为提取溶剂。此外，本课题组还对不同超声提取时间（30、45、60 min）进行了考察。结果发现，超声60 min时的峰面积低于超声30、45 min，而超声30、45 min提取时的峰面积差异不大，故考虑到节约时间和成本，本研究最终选择超声提取时间为30 min。

不同品种党参药材中5种有效成分含量存在较大差异，党参中党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅱ和苍术内酯Ⅲ的含量整体高于其他品种，素花党参中苍术内酯Ⅰ含量较高。究其原因可能与不同产地和不同来源党参受品种、气候、生长环境、土壤、水分、施肥及栽培方式等多种因素的影响有关[22-23]。6～10月采收的党参药材中均以党参炔苷含量最高;6～10月苍术内酯Ⅰ含量较低，8月苍术内酯Ⅱ未检出，9月丁香苷、苍术内酯Ⅱ含量较低。究其原因可能与不同采收期环境中生态因素（如土壤温度、空气温度、空气湿度、光合有效辐射等）会发生不同程度的变化等有关[24-25]。

综上所述，本研究所建HPLC法操作简单、准确、灵敏度高、重复性好，可用于同时测定不同品种及采收期党参药材中5种有效成分的含量;不同品种及采收期党参药材中5种有效成分的含量存在较大差异，基原和采收期可能是影响党参质量的因素之一。

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（收稿日期：2019-09-13 修回日期：2020-05-30）

（编辑：陈 宏）