医院感染分子生物学研究方法进展

邵宜波 顾有为 李旭

[摘要] 为建立合理的感染控制措施，医院感染病原菌流行病学调查非常重要。本文阐述了在医院感染领域运用分子流行病学调查方法的进展，并列举了其在医院感染暴发流行病调查中的应用。分子生物学方法主要包括两类：DNA检测技术，如扩增片段长度多态性分析、质粒指纹图谱分析、聚合酶链式反应、脉冲场凝胶电泳技术、DNA测序技术等;蛋白质检测技术，如多位点酶电泳法、免疫印迹技术。各种方法均有优缺点，实际操作中选用何种分型方法，应根据情况来选择。合理的分子流行病学分型方法的使用对医院感染控制工作非常重要。

[关键词] 医院感染;流行病学分型;分子生物学;进展

[中图分类号] R181          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）07（c）-0038-04

The progress in research methods in molecular biology of nosocomial infection

SHAO Yibo   GU Youwei   LI Xu

Department of Infection Management， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Anhui Province， Hefei   230022， China

[Abstract] The epidemiological investigation of nosocomial infection pathogens is crucial to establish reasonable infection control measures. In this paper， the progress of molecular biological methods in the epidemiological investigation of nosocomial infection pathogens is described， and the application of some molecular biological methods in the epidemiological investigation of nosocomial infection outbreaks is listed. These molecular typing methods can be categorized into two main groups： DNA-based methods， such as amplified fragment length polymorphism， plasmid fingerprinting， polymerase chain reaction， pulsed field gel electrophoresis and DNA sequencing technology; protein-based methods， such as mutilocus enzyme electrophoresis and immunoblotting. Both kinds of methods have advantages and disadvantages. Therefore， which typing method is employed in practice should be selected based on the situation. It is very important for nosocomial infections to use a reasonable molecular biological typing method.

[Key words] Nosocomial infection; Epidemiologic typing; Molecular biology; Progress

医院感染具有明显的致死与致残率非常高的特点，已经成为住院患者健康及患者预后的最大影响因素。医院感染的发生与各种微生物都有关，其中最为常见的是细菌。近年来感染控制领域难题及焦点是多重耐药菌的感染，为提供有效的感染控制措施，医院感染流行病学调查非常重要，这就需要了解病原菌在医院内的亲缘关系和分布。我们通常采用各种分型技术来确定病原菌的亲缘性，其中传统分型法如细菌素、噬菌体和血清学分型等，这些分型法虽然有用，但容易受多种因素的影响，有很大的变异性，其重复性不佳，工作时间长，工作量也大，不利于医院感染的监控。目前采用核酸技术分析医院感染发生、发展规律，能更加精準高效地完成医院感染的管理控制，已经成为国际医院感染管理研究中的重要方向。近年来，随着分子生物学技术在实验诊断中的广泛应用，分子生物学方法在医院感染的暴发事件定性判定、医院感染的引发病原菌定型判定、医院感染的溯源等方面发挥日益显著的作用[1-2]。

目前，在预防医学、医院感染的预防控制、细菌流行病学等领域已广泛采用分子基因分型技术，如脉冲场凝胶电泳技术、多位点序列分型技术、限制性内切酶技术、质粒指纹图谱分析方法等。而使用合理的分子生物学分型方法，对医院感染工作非常重要。本文就医院感染常用的分型方法展开综述，重点阐述各种方法的原理和最新研究进展，并对其应用情况和优缺点进行讨论。

1 DNA检测技术

决定一切生物物种最基本的因子就是DNA分子上的功能片段——基因，它是遗传信息的基本单位，医院感染流行病学分析的重要方法之一是DNA检测技术，它不需要特殊仪器、设备，操作简单，节省时间，稳定性和可重复性较高，可以广泛用于病原体分型。DNA检测的图谱具有高度特异性，可以从基因水平来进行分型，可将不同菌株区分开来。缺点是受核酸酶消化、提取技术及电泳条件等影响，难以统一标准。

1.1 扩增片段长度多态性（AFLP）分析

作为一种新的分子标记技术——AFLP技术，该技术已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增基因组DNA特定片段，先用限制性内切酶切割基因组DNA，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点进行多态性分析。AFLP结合了限制性片段长度多态性（RFLP）和PCR技术高效性和稳定性的优点，扩增出现特定的DNA条带可以作为一种分子标记，即引物诱导及DNA扩增后得到的多态DNA。由于基因组的序列差异及酶切时产生的片段长度、大小不完全相同，不同菌株之间的差异通过扩增便能显示出来，图谱上表现为多种条带图形。可作为不同实验室之间的标准比较[3-4]。另外AFLP产量多，时间效率高，对细菌的分型和鉴定的操作重复性较强，因此，在调查公共卫生流行病学时更有代表性和权威性。然而，AFLP依赖昂贵的仪器设备与耗材，阻碍了AFLP的普及应用。

1.2 质粒指纹图谱分析

质粒含有多种耐药基因，是位于细菌染色体外的遗传物质。质粒分析的基本原理是根据质粒DNA电泳条带所构成的特异性图谱对质粒进行指纹图谱分析，适用于许多细菌，有助于医院感染流行病学原因调查分析。目前质粒分析方法已简化，费用已降低，具体步骤是将细菌质粒提取进行常规凝胶电泳，用限制性核酸内切酶如EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ切割细菌质粒，再分析切割出的片段长度和数目，提高细菌的鉴别能力。该方法具有诸多特点和优点，优点是实验操作难度较低、实验耗时较短、实验经费开销较小;该方法的缺陷在于部分细菌不含质粒、部分细菌的质粒会自发丢失，基因重排会改变酶切酶谱[5]。

1.3 PCR

PCR由于实验时间短且操作过程简便，被广泛应用。PCR一般用限制性核酸内切酶消化PCR产物后通过电泳方法来分析结果。目前在实验室应用比较成熟的以PCR为基础的方法主要有以下三种：随机引物PCR（AP-PCR）、tRNA-PCR和rep-PCR。AP-PCR是将目的DNA用一段短序列随机扩增一些片段，根据这些片段来进行病原体分型。tRNA-PCR是使用tRNA基因作为引物来扩增目的病原体的DNA。rep-PCR是由于细菌基因组中广泛分布着短重复序列，即基因外重复回文序列（REP），通过扩增这些系列来获得菌株特异性图谱[6]。但这三种方法也有其局限性，AP-PCR重复性较低，tRNA-PCR鉴别力较差，rep-PCR引物较长，因此需要较高的退火温度。Percin等[7]通过rep-PCR将多黏菌素耐药鲍曼不动杆菌分为三个不同的克隆型。Senok等[8]使用rep-PCR技术研究鲍曼不动杆菌造成的医院流行暴发。相比传统PCR技术，rep-PCR优点明确：转化效率高、时间效率高、DNA需要量较小，可用于耐药基因的检测[9-10]。

1.4 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

1984年Schwartz等[11]第一次使用PFGE技术成功分离酿酒酵母染色体DNA。作为细菌分子流行病学分型的“金标准”，PFGE技术具有分辨率高、实验重复性好等优点，是一种被普遍适用的分子检测技术，在细菌及真菌的分型上，显示出较好的鉴别力和重复性。在常规凝胶电泳的基础上，PFGE通过不断变化电场强度，使大片段DNA分子加速溶解。用低频裂解限制性核酸内切酶把目标染色体DNA（细菌或真菌）切成多个大小不等的片段，然后进行电泳分析。其特点是对样品需求量小，操作方便，费时少，分辨率、灵敏度较高。一般情况下，PFGE图谱在细菌的暴发流行株间相似，容易判断[12-13]。但是一旦染色体发生变异事件，如DNA缺失、插入或点突变时，其图谱条带就有相应改变。目前，PFGE已成功应用于细菌的流行病学研究[14-17]。但是，PFGE图谱分析，花费时间长，过程细节多，操作步骤与操作人员技术高低有关，如果图谱结果不一致，就会对实验室结果之间的比较产生影响，且实验周期长，使用的仪器及材料较多、较贵。目前已出现了第二代快速的PFGE方法进行基因分型，这无疑对PFGE起到积极的推动作用。

1.5 DNA测序技术

随着DNA测序方法的改进，细菌分子分型技术也日益成熟，其中下述两种DNA测序技术发展较快。

1.5.1 多位点序列分型（MLST）  MLST主要基于核酸序列测定，它已成为细菌的常规分型方法。通过PCR扩增多个管家基因内部片段来测定其序列，可以在全球不同实验室之间分析比较不同菌株的差异。优点是更加快速和准确、适合流行病学调查，由于可以快速比较分析细菌的流行病学和进化研究方面数据结果，更有利于临床及时采取有效的控制措施[18]。国内学者最近也用该方法来研究屎肠球菌和粪肠球菌等具有耐药特性菌株的遗传背景[19]。该方法通过PCR扩增测序分析不同的管家基因内部片段序列型（ST），然后通过比较ST对细菌进行分型。MLST可通过研究管家基因与参考菌株的相应序列构建进化树来判断菌种归属，可以用于菌株的鉴定及变异[20]。有人用PFGE和MLST方法对单核细胞增生李斯特菌开展了分型方面的研究[21]。Mezzatesta等[22]研究鲍曼不动杆菌时发现，MLST和PFGE在分辨力和可重复性方面是相同的，该技术可直接分析临床标本，操作简便、实用型强，數据可实现网络共享，越来越多地被作为进行国际间菌株比较的常用工具、进行生物进化和种群结构的研究。但该技术的不足之处是必须事先掌握待检测微生物的基因组序列，才能推测出该微生物的决定基因，因该方法对DNA测序的依赖程度太高且实验费用较昂贵，制约了其应用范围。

1.5.2 高通量测序技术（深度测序技术）  该技术的诞生是基因组学研究领域的一个里程碑，使一个物种的转录组和基因组序列全面分析成为可能，所以又被称为深度测序。与第一代测序技术相比，该技术极大降低了核酸测序单碱基的成本。以人类基因组测序为例，20世纪末进行的人类基因组计划花费30亿美元解码了人类生命密码，而第二代测序使人类基因组测序进入万（美）元基因组时代。降低的单碱基测序成本可以揭示更多生物物种的基因组遗传密码。同时在已完成基因组序列测定的物种中，对其大规模的全基因组重测序也成为现实。它具有检测速度快、全面、错误少及数量大等特点，相对于传统测序技术，高通量测序技术测定序列量大，可以一次对多达几百万条DNA分子同时进行序列测定[23-24]，可见其对时代变化的影响。有研究表明[25-26]，该技术对微生物多样性分析研究效果较好。虽然测序速度快，但测序所需仪器价格较高，且对大数据的分析处理过程复杂，因此不适合小规模测序。

2 蛋白质检测技术

2.1 多位点酶电泳法

多位点酶电泳法又称同工酶电泳法，可用于病原体分型，对临床细菌具有一定的分型能力，原理是根据在凝胶中的蛋白质电泳迁移率不同来进行分型，而电泳迁移率不同是由于氨基酸不同造成的，将蛋白电泳后结果与标准结果来进行分型比较。应用在分子流行病学和遗传学方面，比传统的细菌分类学方法具有更多的优势，可以分辨出被检测的所有菌株的型别，解释菌株的群体遗传差异及两菌株的遗传距离等。从实验过程来说，此操作流程比较简单，不需要特殊的仪器，PCR探针杂交等技术成本便宜，适宜于基层单位推广应用。尽管如此，作为一种方法，多位点酶电泳法还是有它的局限性，譬如有的病原体不含有某一同工酶，另外，很多的因素可以影响实验结果。

2.2 免疫印迹技术

免疫印迹法又称蛋白质印迹法，它是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。可以通过特异性抗原抗体反应来检测某种蛋白是否存在于样品中。其具有高分辨力、高特异性、强敏感性的优点，已成为检测蛋白质表达与分布特性最有效且最常规的技术[27]。目前在医院感染的流行病学分析方面取得一定的效果，其操作是将电泳后的细菌蛋白转移到硝酸纤维膜上，与相应的抗体反应后，用酶标第二抗体来测定目标细菌的抗原。但该技术缺点是转移过程容易出现大量干扰条带，同时易受操作者提取技术和细菌自身环境影响。

3 小结

通过对各种类型方法的综述，不同类型的分型技术具有各自的长处和短处。实际操作中选用何种分型方法，应参照指标与需求来选取。既要考虑到分辨能力又要考虑到实验的重复性，同时要综合实验成本、实验室资源以及实验者本身的操作技能和知识水平。

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（收稿日期：2020-03-10）