饲鸽者肺SD大鼠模型的建立及病理表现研究

牛宗新 邬超 李亚防 廉志闯 杨晓红

【摘要】 目的：建立饲鸽者肺SD大鼠模型，比较不同时期饲鸽者肺模型的病理表现。方法：选用清洁级健康SD大鼠36只，随机分为两组，对照组12只，实验组24只。对照组给予0.9%氯化钠溶液雾化吸入，实验组给予鸽子粪便、羽毛、皮屑等脱落物制备冻干粉溶液雾化吸入，2 h/d，共16周。造模第1、2、4、12、14周，实验组随机选取3只大鼠取组织标本。第16周处死全部大鼠。结果：造模第1周出现急性期表现，第2～14周均为亚急性期表现，第16周开始出现慢性期表现，实验组和对照组病理表现比较差异有统计学意义（P=0.000）。结论：鸽子粪便、羽毛、皮屑等脱落物的蛋白提取物可以构建不同病理分期的饲鸽者肺SD大鼠动物模型，可根据需求选择不同的时间造模。

【关键词】 饲鸽者肺 SD大鼠 动物模型

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.19.070 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2020）19-0-03

Study on the Establishment and Pathological Performance of Lung SD Rat Models in Pigeon Breeder's Lung/NIU Zongxin， WU Chao， LI Yafang， LIAN Zhichuang， YANG Xiaohong. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（19）： -174

[Abstract] Objective： To establish a Sprague-Dawley rat （SD rat） model of the pigeon breeder's lung and to compare the pathological performance of the lung model of pigeon breeder in different periods. Method： A total of 36 clean-level health SD rats were randomly divided into 2 groups， 12 cases in the control group and 24 cases in the experimental group. Rats in the control group were atomized inhaled of 0.9% Sodium Chloride Solution， rats in the experimental group were atomized inhaled with Freeze-dried Powder Solution which were made up by pigeon dung， feathers and dander， 2 hours per day， for a period of 16 weeks. At the 1， 2， 4， 12， 14 week of intervention， 3 rats were randomly selected from the experimental group to execute for their lung tissue samples. All rats were executed in week 16. Result： The pathological characteristics of acute period were observed in the first week， the pathological characteristics of subacute period were observed in week 2 to 14， chronic period performance in week 16. There were statistically significant differences in pathological manifestations between the experimental group and the control group （P=0.000）. Conclusion： The freeze-dried powder solution which were made up of pigeon dung， feathers， and dander can establish SD rat models of pigeon breeders lung， and choose different time according to the need.

[Key words] Pigeon breeders lung Sprague-Dawley rat Animal models

First-authors address： Shihezi University Medical School， Shihezi 832002， China

飼鸽者肺（pigeon breeders lung，PBL）属于外源性过敏性肺泡炎或过敏性肺炎（hypersensitivity pneumonitis， HP），是敏感个体反复吸入鸽子粪便、羽毛、皮屑等脱落物蛋白后诱发的肺部炎症反应性疾病[1-2]。饲鸽者肺急性期症状有发热、咳嗽、乏力等非特异性症状[3]，亚急性期主要表现为胸闷、气短等症状[4]。临床工作中该疾病诊断困难，早期病变很少行肺活检，病理资料相对较少，本实验旨在建立饲鸽者肺动物模型为后续该疾病研究提供一定帮助，并观察研究各期病理改变，对该疾病进一步研究及临床诊断提供一定帮助，具体如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用清洁级健康成年SD大鼠（sprague-dawley rat， SD Rat），雌雄不拘，6～8周龄，体重180～200 g，购于常州卡文斯动物实验有限公司，实验动物许可证号：SCXK（苏）2016-0010。SD大鼠饲养环境通风良好，保持清洁，饲养温度保持在21 ℃～24 ℃，相对湿度45%～50%，用标准大鼠箱饲养，2～3只/箱，水料充足。适应性饲养1周后，将36只SD大鼠编号1～36，根据体重是否大于190 g将大鼠分为A组、B组，再使用抽签的方法将两组各随机分为三组（A1～A3，B1～B3），其中A1和B1组合成对照组（12只），A2、A3、B2、B3组合为实验组（24只）。实验试剂：无水乙醇、二甲苯、中性树脂购于国药集团化学试剂有限公司，苏木素、伊红染液购于珠海贝索，盐酸购于南京化学试剂有限公司，氨水购于上海凌峰化学试剂有限公司。实验仪器：超声波雾化器（粤华，WH-2000），组织脱水机（常州普锐斯新，PQT-A），组织包埋机（常州普锐斯新，PBM-A），石蜡切片机（德国徕卡，RM2235），光学显微镜（日本尼康，NIKON H550S）。

1.2 方法

收集新鲜的鸽子粪便、羽毛、皮屑等脱落物，并按照1∶20体积的磷酸盐缓冲盐溶液室温搅拌24 h。用50%硫酸铵混合后萃取，得到部分饱和溶液。将部分饱和溶液用蒸馏水充分透析并冻干保存。在进行吸入试验之前，将10 mg冻干粉与1 ml蒸馏水一起搅拌，并以12 000转/min的速度离心3次，持续30 min，收集上清液并通过过滤用以雾化吸入[5]。实验将大鼠置于封闭的雾化箱内雾化，2 h/d。对照组雾化吸入0.9%氯化钠溶液，实验组在封闭的雾化箱内对SD大鼠每天雾化2 h，分别于第1、2、4、12、14周从实验组随机选取3只大鼠，行腹腔注射戊巴比妥钠（10 mg/kg）处死大鼠，立即解剖取出肺组织，将肺组织固定于4%多聚甲醛。第16周处死所有实验组剩余大鼠及对照组大鼠。肺组织固定24 h后，取材、组织脱水、石蜡包埋、切片、分别苏木精-伊红（HE）染色及Masson染色，染色后切片由三位病理科医师独立阅片。

1.3 观察指标及评价标准

病理诊断标准采用实用内科学HP诊断标准：急性期表现为肺泡及肺间质内有明显的淋巴细胞、浆细胞、肥大细胞及巨噬细胞浸润，肺泡腔内有渗出物，肺泡毛细血管呈血管炎表现;亚急性期主要表现为细支气管周围淋巴细胞、浆细胞为主的间质浸润，可有非干酪样肉芽肿形成;慢性期表现为肺泡间隔有不同程度的淋巴细胞浸润和胶原纤维增生[6-7]。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料采用Fishers确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

对照组大鼠活动好，食欲正常;实验组大鼠活动略减少，较对照组精神萎靡有咳嗽现象，食欲减低，对外界刺激反应较迟缓。

2.2 病理表现

造模期间两组均无大鼠非计划死亡。实验组第1、2、4、12、14周处死的大鼠病理分期见表1，第1周均为急性期，第2周出现亚急性期表现;第16周处死的实验组及对照组大鼠病理分期见表2，16周出现慢性期表现。实验组病理改变均为阳性，对照组均为正常肺组织，两组比较差异有统计学意义（P=0.000），见表3。大鼠各病理分期结果见图1、图2。

3 讨论

饲鸽者肺的发病原理为宿主反复吸入鸽子粪、鸽子羽毛中含有的蛋白质抗原引起的细胞免疫和体液免疫过敏反应，当宿主反复吸入抗原时，抗原附着于支气管壁及其周围，肺泡壁和细支气管壁由淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，产生炎症反应及后续修复[8]。由于早期临床症状不典型常被患者忽略，或被误诊为其他疾病，亚急性期及晚期由于无特异性检查，难于和其他肺间质病变鉴别诊断[9]。既往动物实验中存在不同抗原提取物的提取方法，本实验采用抗原制作方法参考Ohtani等[5]的制作方法，Edwards等[10-11]也提出过抗原方法，与本实验所使用方法基本类似，使用脱水和稀释液体略有不同。

动物实验中气道造模方法中有气道滴灌、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、气道雾化等实验方式，本实验使用鸽子粪、羽毛、皮屑等脱落提取物制作冻干粉蛋白溶于蒸馏水中，通过雾化气道吸入，模拟现实世界饲鸽者肺发病过程。饲鸽者肺以肺部病变为主，既往动物实验中存在腹腔注射、皮下注射、静脉注射、滴鼻法等实验方式，静脉注射方式一次大量抗原抗体结合，容易引起全身急性免疫反应，容易产生急性肝损伤、多器官功能衰竭等疾病造模，肺部改变效果欠佳，通常用于脓毒症等相关研究[12]。腹腔注射是动物实验中较常用的造模方法，主要原理与静脉注射基本相同，从腹腔血管吸收入血，容易产生注射部位感染或者注射过程中注射至腹腔大血管、腹腔脏器等位置[13]，导致动物非计划性死亡。皮下注射与饲鸽者肺发病机制存在差异，未考虑该方法。经鼻滴入方法通常用于哮喘、鼻炎模型的制作，可能与经鼻滴入后抗原存在于上呼吸道，部分实验动物吞入消化道导致抗原接触不稳定，造模成功率低有一定相关性[14]。

本实验使用过敏原雾化吸入方式模拟现实世界中抗原暴露場景，呼吸道直接暴露于过敏原，雾化抗原微粒通过密闭容器较容易且均匀的吸入SD大鼠肺中，其大小对颗粒沉积位置有直接影响。一般来说，雾化颗粒直径大小和沉积位置关系如下：有效雾化颗粒直径应在0.5～10 μm，颗粒3～5 μm的雾粒主要沉积于肺部，颗粒小于3 μm的雾粒50%～60%沉积于肺泡，雾化器可以使颗粒大小控制在1～5 μm[15]。第一周急性期表现大鼠肺泡腔可见淋巴细胞为主的改变，少量嗜酸细胞浸润，符合饲鸽者肺急性期抗原附着于肺泡壁引起的炎性改变。2～14周肺间质炎症持续反应，支气管周围可见淋巴细胞浸润，可能与巨噬细胞在抗原聚集区域周围释放促炎症因子加重局部炎症反应相关，这可能是饲鸽者肺胸部CT表现为马赛克症及小结节的原因之一[16]。16周可见肺泡及肺泡间隔弥漫性炎细胞浸润和散在胶原纤维增生，胶原纤维增生在炎症后出现通常表示疾病进入慢性阶段。