100株淋球菌对7种抗生素的耐药性结果分析

黎小东, 梁景耀, 曹文苓, 毕超, 李平, 王建琴, 张锡宝

(广州市皮肤病防治所,广东 广州 510095)

淋病是性传播疾病(sexually transmitted diseases，STD)中的乙类传染病，全球建立了众多监测点，各点报道淋球菌对抗生素耐药性日益趋重，对淋病造成巨大威胁[1-2]。监测淋球菌对7种抗生素的耐药情况及其产青霉素酶的淋球菌(penicillinase- producingNeisseriagonorrhoeae,PPNG)和质粒介导的高度耐四环素淋球菌(tetracycline resistantNeisseriagonorrhoeae,TRNG)的流行情况，可为临床治疗淋病提供科学指导。本研究对本单位2019年STD门诊患者分离培养出来的100株淋球菌进行最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)及PPNG、TRNG测定，现将检测结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 100株淋球菌取自2019年1—12月本单位STD患者的泌尿生殖道分泌物，其中来源于男性患者90株，女性患者10株；患者年龄17～73岁。所有菌株经过革兰染色、氧化酶试验和糖发酵试验验证，传代一次后洗于脱脂牛奶中，于-80 ℃低温冰箱冻存备用。

1.1.2 抗生素 青霉素(R082H0，USP)、四环素(R039W0，USP)、环丙沙星(10L049，USP)、大观霉素(H0M399，USP)、头孢曲松(R07420，USP)、头孢克肟(R095XO，USP)、阿奇霉素(R043P0，USP)均由中国疾病预防中心性病控制中心提供。

1.1.3 培养基 淋球菌基础培养基(OXOID公司生产，LOT1784808)加入10% 脱纤维新鲜羊血。

1.1.4 标准菌株 世界卫生组织(World Health Organization,WHO)标准淋球菌菌株D、G、J、L、P由中国疾病预防中心性病控制中心提供。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备 实验菌株和标准菌株用T-M平板培养16～20 h的淋球菌菌苔[3]，用生理盐水制成1×107CFU/mL菌悬液。

1.2.2 MIC测定 采用WHO西太区淋球菌耐药监测规划推荐的琼脂稀释法，先将7种抗菌药物按要求配成原液，再倍比稀释成不同的浓度，青霉素0.03～32 mg/L，环丙沙星0.008～32 mg/L，四环素8～16 mg/L，大观霉素1～128 mg/L，头孢曲松和头孢克肟0.002～1 mg/L，阿奇霉素0.016～8 mg/L。将3.7%淋球菌基础琼脂高压灭菌，水浴冷却至50 ℃，加入脱纤维新鲜羊血(终浓度10%)。取0.2 mL倍比稀释好的7种抗菌药物工作液，加入20 mL淋球菌血液基础培养基，混匀后倾倒平板。从低浓度至高浓度配制各种浓度的平板。用多头接种器将实验菌株和标准菌株菌悬液接种于各种浓度的平板，置36 ℃、5% CO2环境下培养24 h后观察结果，记录无菌落生长的MIC。以WHO的D、G、J、L、P标准菌株作质控。

药物敏感性判断标准采用WHO西太区淋球菌耐药监测规划推荐的标准[4]:青霉素和环丙沙星MIC≤0.03 mg/L为敏感，MIC 0.06～0.50 mg/L为低敏，MIC≥1 mg/L为耐药；四环素MIC ≥16 mg/L为TRNG；头孢曲松MIC≤0.06 mg/L为敏感，MIC≥0.125 mg/L为低敏；头孢克肟MIC≤0.125 mg/L为敏感，MIC≥0.25 mg/L为低敏；大观霉素MIC≤64 mg/L为敏感，MIC≥ 128 mg/L为耐药；阿奇霉素MIC≤0.5 mg/L为敏感，MIC≥1 mg/L为耐药。

1.2.3 β-内酰胺酶测定 采用纸片碘量法测定菌株是否产β-内酰胺酶，具体操作如下：在试管中加入100 μL青霉素溶液(10 000 U/mL)、100 μL淀粉溶液(1%)、50 μL碘试剂，呈蓝色混合物，在一滤纸条上滴50 μL试剂，将一接种环培养物涂在蓝点上，放置1～2 min，如蓝色变成无色即为β-内酰胺酶阳性，颜色无变化则为阴性。每次试验以WHO J株作阳性对照，D株作阴性对照。β-内酰胺酶阳性为PPNG。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0进行统计学分析，PPNG和TRNG检出率、各地同一药物的耐药率、低敏率等计数资料比较采用2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPNG和TRNG结果

100株淋球菌中检出PPNG 35株， 阳性率为35%(35/100)；检出TRNG 32株，阳性率为32%(32/100)。

2.2 MIC结果分布

100株淋球菌对大观霉素均敏感，无耐药株；环丙沙星耐药株99株(99%)，无敏感株；青霉素耐药株93株(93%)，敏感株2株(2%)；头孢曲松敏感株78株(78%)，低敏株22株(22%)；头孢克肟敏感株81株(81%)，低敏株19株(19%)；阿奇霉素敏感株90株(90%)，耐药株10株(10%)；四环素MIC≥16 mg/L 32株,MIC≤8 mg/L 68株。详见表1、表2。

表1 100株淋球菌MIC分布 株Tab.1 The MIC of 100 strains of Neisseria gonorrhoeae Strain

43株MIC≥16 mg/L的环丙沙星耐药菌中：PPNG 11株、TRNG 13株；同时是PPNG和TRNG的三重耐药菌5株，并阿奇霉素MIC≥8 mg/L的四重耐药菌1株；并阿奇霉素MIC≥1 mg/L和并阿奇霉素MIC≥8 mg/L的双重耐药菌分别有7株和2株。4株MIC≥8 mg/L的阿奇霉素耐药菌中，TRNG 3株。

表2 100株淋球菌抗菌活性检测 株(%)Tab.2 Antibacterial activity of 100 strains of Neisseria gonorrhoeae Strains(%)

3 讨论

淋病男女发病率差异较大[2]。本研究显示2019年本单位STD门诊的淋球菌株来源男女比例为9 ∶1，可能与女性症状不明显及漏诊等相关，建议STD门诊患者，尤其是女性患者常规做淋球菌培养。

淋球菌耐药性因时间和地区不同而有所差异[1,5]。本研究中，青霉素耐药率93%，与本地区2008—2014年青霉素耐药率(87%)[5]比较无明显差异(2=2.84，P>0.05)，与浙江(90%)[6]、山东(96%)[7]接近，与江门(63%)[1]有明显差异(2=33.0，P<0.05)。本研究中PPNG检出率为35%，与2000—2005年PPNG(24%)[5]比较有差异 (2=6.18，P<0.05)，与2008—2014年PPNG (36%)[5]比较无明显差异(2=0.08，P>0.05)，说明PPNG呈平缓阶段。四环素耐药率一直居高不下。本研究中TRNG(MIC≥16 mg/L)检出率为32%，与2000—2005年TRNG(33%)[5]相比无明显差异(2=0.08，P>0.05)，与2008—2014年TRNG(43%)[5]相比有差异(2=4.06，P<0.05)，TRNG呈下降趋势。本年度PPNG、TRNG检出率类似于东莞[8]，与广西2013—2016年PPNG、TRNG的结果相似[9]，但与江门PPNG、TRNG的趋势刚好相反[1]。青霉素与四环素已不作为治疗淋病首选药，但PPNG、TRNG仍是淋球菌耐药性监测的重要指标。耐青霉素的菌株常对四环素和环丙沙星交叉耐药，本实验数据显示，在43株环丙沙星高度耐药(MIC ≥16 mg/L)株中，同时检出PPNG菌株11株(11%)；TRNG菌株13株(13%)；与阿奇霉素(MIC≥1 mg/L)双重耐药菌株7株(7%)；同时检出 PPNG、TRNG三重耐药菌株5株(5%)，与本地区2007年(9.5%)[10]比较无明显差异(2=1.32，P>0.05)。

本年度环丙沙星耐药率(99%)与2008—2014年(98%)一致[5]，与浙江(100%)[6]、山东(96%)[7]接近，说明本地区环丙沙星耐药率居高不下，且多重耐药性，可能与环丙沙星属氟喹诺酮类药物，为泌尿感染的常用药而使用广泛有关，有待临床筛查环丙沙星耐药基因[11]和及时监测有效药物。

本年度阿奇霉素耐药率(10%)与2016年阿奇霉素耐药率(15%)[10]比较无明显差异(2=1.1，P>0.05)，但高于山东[7]的报道。在4株阿奇霉素(MIC≥8 mg/L)耐药菌株中，TRNG 3株(3%)；与环丙沙星(MIC≥16 mg/L)双重耐药菌株2株(2%)； 同时检出PPNR、TRNG和环丙沙星四重耐药菌株1株(1%)。阿奇霉素多重耐药问题应引起临床重视。

头孢曲松、头孢克肟和大观霉素都未见耐药菌株，但头孢曲松、头孢克肟低敏率分别为22%、19%，与2016年的头孢曲松、头孢克肟低敏率(25%、33%)[12]比较无明显差异(2值分别为0.39、5.29,P值均>0.05),呈持平趋势。头孢曲松低敏率(22%)远高于浙江(6%)[6]和山东(2%)[7]低敏率。国内也可见头孢曲松耐药的报导[13]，可能与地区和/或标本来源不同有关，也可能与各地区的性活动、性行为和药物选择、治疗习惯(如伴侣没有同时治疗等)不同有关。

综上所述，本研究显示，大观霉素抗菌活性最强，头孢曲松、头孢克肟未见耐药株，可推荐为广州地区治疗淋病的首选药物,但需长期监测其淋球菌耐药性；阿奇霉素多重耐药株出现，不再单一用药，建议联合头孢曲松用药；青霉素、四环素和环丙沙星已不再是淋病治疗主要药物[8-10]，但需关注其导致淋球菌耐药性传播问题和联合用药导致选择性耐药产生的问题。