青海玉树地区藏族与汉族儿童外周血淋巴细胞亚群参考区间的建立及比对分析

范亚莉，洪军，殷青宁，周林平，巨巧云，马绍青，王积川(青海省妇女儿童医院急诊科，西宁 810007)

外周血淋巴细胞亚群已成为评价人类免疫系统状态的重要指标[1]，许多疾病如感染、自身免疫性疾病和血液系统肿瘤的发生均与淋巴细胞亚群有关，因此，建立健康人群外周血淋巴细胞亚群的参考区间尤其重要。研究表明，淋巴细胞亚群的参考区间受年龄、性别、民族和区域等因素影响[2]；另有学者发现，高原低氧环境可影响机体的免疫调节功能[3]。然而，国内文献报道的研究对象多集中于成年人，其年龄范围相对狭窄。目前针对我国高海拔地区(>3 000 m)藏族健康儿童的免疫状态评估尚未见报道。因此，本研究拟检测青海玉树地区755例藏族和174例汉族健康儿童淋巴细胞亚群的分布情况，并比较不同民族、不同性别和不同年龄之间的差异，以期为临床诊疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2018年12月至2019年12月青海省妇女儿童医院体检中心进行健康体检且世居在海拔>3 000 m的青海玉树地区的藏族儿童755例及汉族儿童174例，其中，藏族儿童中男458例，女297例，年龄(8.0±3.4)岁，学龄前组(3～6岁)439例，少年组(7～14岁)316例；汉族儿童中男81例，女93例，年龄(8.6±3.0)岁，学龄前组(3～6岁)76例，少年组(7～14岁)98例，两组性别和年龄差异无统计学意义。纳入及排除标准：(1)外周血细胞计数、肝肾功能、X线检查无异常；(2)无心、脑血管疾病；(3)无先天性免疫缺陷性疾病和自身免疫性疾病；(4)无3周内发生感染性疾病及急性时相反应；(5)无HBV、HCB、HIV 和梅毒等慢性感染性疾病；(6)近期未使用过影响免疫系统的药物。选取同期于青海省妇女儿童医院体检中心就诊且世居玉树地区的50例藏族健康成年人(19～60岁)，男25例，女25例，年龄(38±2.5)岁。本研究经青海省妇女儿童医院医学伦理学委员会批准 (批准文号：2017院伦审研第1号)，健康成年人及患儿家属均知情同意。

1.2主要仪器与试剂 FACS cantoⅡ型流式细胞仪、淋巴细胞亚群检测试剂盒(MultiTestTMIMK Kit，货号340503)、相同荧光素标记的鼠抗同型对照IgG2a和溶血素(货号349202)、四色荧光校准微球均购自美国BD公司。

1.3流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群 无菌采集各研究对象清晨空腹静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝，室温静置30 min。充分混匀后取50 μL抗凝血分别加入3个流式管(2管样品管，1管同型对照)中，其中样品管1中加入CD4FITC/CD8PE/CD45percp/CD3APC组合抗体20 μL，管2中加入CD3FITC/CD16+56PE/CD45percp/CD19APC组合抗体20 μL，同型对照管中加入相同荧光素标记的的鼠抗同型对照IgG2a 20 μL，充分混匀，室温避光温育20 min，每管中加入1 000 μL溶血素，混匀后室温避光静置20 min；加入2 000 μL PBS，377×g离心5 min；弃上清，加入500 μL PBS重悬混匀后，2 h内上机使用MuhiSET自动分析软件自动获取淋巴细胞亚群相对计数结果，结果符合公式:T%+B%+NK%%±5%和Th%+Ts%=T%±5%即为可信。每次样品检测前使用专用四色荧光校准微球进行仪器校准，以保证检测结果的可靠性。

1.4统计学分析 采用 SPSS 23.0软件进行分析，计量资料不符合正态分布，以中位数(四分位数)[M(P25,P75)]表示，以(P2.5,P97.5)计算 95%参考值区间。两组间比较采用Wilcxon秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同年龄儿童之间淋巴细胞亚群检测结果比较 藏族健康儿童学龄前组和少年组之间比较，CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞、CD4+/CD8+比值差异无统计学意义(P>0.05)，而B和NK细胞差异有统计学意义(P<0.05)；汉族健康儿童学龄前组和少年组之间比较，CD3+T、CD4+T和NK细胞差异无统计学意义(P>0.05)，但CD8+T、B细胞和CD4+/CD8+之间差异有统计学意义(P<0.05)。藏族和汉族健康儿童总计之间比较结果表明，CD4+T、CD8+T细胞和CD4+/CD8+差异有统计学意义(Z分别为-3.114、-4.840和-4.582,P均<0.01)，但CD3+T、B和NK细胞之间差异无统计学意义(Z分别为-0.198、-0.996和-4.453,P均>0.05)。见表1。

表1不同民族儿童外周血淋巴细胞亚群检测结果[M(P25,P75)]

2.2同民族不同性别儿童之间淋巴细胞亚群检测结果比较 藏族健康儿童男性和女性之间比较，各检测项目差异均有统计学意义(P<0.05)，而汉族健康儿童男性和女性之间比较，各检测项目差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2同民族不同性别儿童之间外周血淋巴细胞亚群结果[M(P25,P75)]

2.3本研究建立的参考区间与其他地区比较结果 与国内已发表的相关文献比较，本研究建立的健康儿童淋巴细胞亚群参考区间存在较大的差异。见表3。

表3本研究与其他文献报道的外周血淋巴细胞亚群参考区间的对比

3 讨论

T淋巴细胞亚群分析是评估免疫功能的重要指标，一项调查结果表明，外周血淋巴细胞亚群分布受地域、种族、年龄和性别影响[8]。本研究中不同年龄之间比较结果表明，藏族学龄前组和少年组之间B和NK细胞差异有统计学意义；汉族学龄前组和少年组之间CD8+T、B细胞和CD4+/CD8+差异有统计学意义，表明年龄是造成部分淋巴细胞亚群指标差异的重要因素，这与王文第等[5]和林珊等[6]报道的结果相似，分析原因可能与发育过程中受到更多暴露抗原刺激，免疫系统逐渐成熟而导致分布不同有关。本研究中藏族健康儿童各年龄段的所有淋巴细胞亚群指标均有性别的差异，其中男性CD3+T和CD8+T细胞高于女性，B细胞低于女性，其余指标分布特点和王永顺等[8]研究结果一致。王文第等[5]、林姗等[6]和肖婧等[7]研究结果表明，汉族健康儿童T、CD4+T、B和NK细胞百分比差异有统计学意义；但张志平等[9]研究结果表明，汉族健康儿童男女性别间T、CD4+T、CD8+T、B和NK细胞的百分率比较差异均无统计学意义。本研究结果中汉族健康儿童各年龄段的所有淋巴细胞亚群指标均无性别差异(P>0.05)，与张志平等[9]的研究结果相一致，而与王文第等[5]、林姗等[6]和肖婧等[7]研究结果明显不同。由此可见，高海拔地区藏族成年人和儿童男女之间淋巴细胞亚群分布特点存在差异，与高海拔地区汉族亦有不同的分布特点，这可能是由于不同民族男女在高海拔环境下机体对免疫功能的调节不同。周晶萍等[3]对海拔 4 500 m地区健康成年人T 细胞亚群进行了对比，发现藏族人群CD4+T和CD8+T细胞虽然高于汉族人群，但差异无统计学意义，而藏族人群NK细胞明显低于汉族人群；B细胞明显高于汉族人群(P<0.05)。本研究结果表明，藏族和汉族儿童仅CD4+T和CD8+T差异有统计学意义(P<0.05)，藏族CD4+T细胞表达水平低于汉族， CD8+T细胞表达水平高于汉族(P<0.05)，表明同一海拔下健康成年人和儿童具有不同的民族差异特点，这可能提示不同民族和年龄适应高原低氧环境产生的生理性改变，免疫系统会做出适当的调整。此外，本研究结果与全国其他地区相比，总体上均存在一定差异，这可能与样本量、地理环境与生活习惯相关，也可能与检测和统计方法的不同相关，临床实验室若直接沿用诊断试剂公司提供的参考区间，也会造成一定误差，所以建立本地的参考区间显得十分必要。

本研究成功建立了青海玉树地区藏族和汉族健康儿童淋巴细胞亚群的参考区间，对相关疾病的诊断分期、治疗评价、和预后判断提供了实验依据，但由于本研究样本只选取了青海玉树地区的健康儿童作为研究对象，且年龄分布相对集中，汉族儿童男女例数小于100例，所得到的参考区间还需要在更大样本量及多地区的研究中进一步验证。