具有拮抗葡萄灰霉菌的生防酵母菌分离与筛选

张栋园，王晓妍，李 宁*，潘巨忠

(1.天津农学院 园艺园林学院，天津 300384；2.宁波市鄞州赛弗兑食品科技有限公司，浙江 宁波 315100)

葡萄灰霉病(graymold)是由灰葡萄孢(Botrytiscrnerea)引起的一种比较常见的并且危害非常严重病害，目前全球范围内发生较多且危害比较严重的病害,在生长期及贮藏期均可发生[1-2]。目前防治葡萄灰霉病主要以化学药物防治为主，但由于化学防治的种种弊端，葡萄灰霉病害的生物防治研究已经受到广大研究者的普遍关注。拮抗酵母菌作为采后生物防治的新方法，具有保护环境、安全的特点，可以替代化学杀菌剂[3-5]。酵母菌不产生毒素，代谢产物天然、易分解，对人体不会构成威胁，并且大量存在于水果、蔬菜的表面，且许多酵母菌已经成为食品工业中重要的添加剂，具有较好的应用基础[6-7]。近年来，虽然拮抗酵母菌在多种果实采后病害防治上取得一定的进展[9]。但是，真正应用于葡萄采后病害防治的报道还很少见。为提高葡萄采后的生物防治效果，笔者从不同食材(苹果、葡萄、梨、香蕉、石榴、芒果、杨桃，木瓜中分离筛选出21株酵母菌并通过采用对峙培养，平皿对扣培养，孢子萌发法和果实活体接种筛选出1 株对葡萄采后灰霉菌具有生防潜力的拮抗酵母菌，旨在为葡萄采后的生物防治提供理论基础和菌种资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

从王顶堤批发市场购买大小一致，成熟度8～9成的苹果(品种红富士)、葡萄(品种红提)、梨(苹果梨)、香蕉(仙人蕉)、石榴(品种黄里石榴)、芒果(小台农芒)、杨桃(七根松杨桃)，木瓜等无病虫和机械伤口的果实用于酵母菌的分离与筛选。

1.2 供试酵母菌

从供试材料的果皮和果肉分离中分离得到。

1.3 供试灰霉菌

葡萄灰霉菌(BotrytiscinereaPers)：由天津农学院植物病理实验室提供。

1.4 供试培养基

PDA培养基， PDB培养基，YEPD培养基：采用常规方法制备。

2 实验方法

2.1 酵母菌的分离与纯化

材料中酵母菌的分离与筛选：分别取不同水果的果皮和果肉5 g，加入50 mL无菌水研磨成浆，然后进行梯度稀释，最后分别用1×10-3，1×10-4，1×10-5进行平板涂布，封口膜封口置于28℃培养箱中进行培养，待长出单菌落后及时进行转入新的培养基上进行纯化。

2.2 不同酵母菌的离体抑菌效果测定

将已经配置好的马铃薯培养基加热至融化，加入100 μL的72%链霉素(防治细菌污染),然后倒平板，待平板中的培养基凝固后在培养皿背面划中线，在中线一侧接入纯化好的酵母菌，在中线另一侧接上葡萄灰霉病菌饼，用封口膜密封培养，放入培养箱中进行平皿对峙培养，重复3次，并以无菌水作为对照，48 h后，测量葡萄灰霉菌菌落的长直径和短直径，通过公式计算抑制率。

抑制率=(处理皿菌落长直径-处理皿菌落短直径)/处理皿菌落长直径×100%

2.3 不同酵母菌的产挥发性物质抑菌效果测定

采用双皿对扣法测定不同酵母菌对葡萄灰霉病抑菌效果测定。向灭好菌的培养皿底加入15 mL的培养基，在一个培养皿底中接入酵母菌，在另一个培养皿底中央接入葡萄灰霉病菌饼，然后将接有灰霉病菌饼的平板和接入酵母菌的平板对扣，酵母菌在下，菌饼在上，用封口膜密封，每一个处理重复3次，放在培养箱中培养，在对照组中，将涂了无菌水的平板和接入菌病的平板对扣，72 h后，测量葡萄灰霉病菌饼的直径。测量方法：接种72 h后测量菌饼直径，测量完毕之后利用公式计算出各种酵母菌对葡萄灰霉病的抑制率。

抑制率=(对照皿菌落直径-处理皿菌落直径)/对照皿菌落直径×100%

2.4 数据处理

计算所得试验数据的平均值，用SPSS Statistics处理数据并进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 不同材料中酵母菌分离纯化结果及抑菌效果初筛

通过对各种水果食材中酵母菌的分离得到21株酵母菌并编号，并对其抑制效果进行测定(见表1)：其中以下10株酵母菌具有明显的抑菌效果：L-4，PG-2，SL-1，YT-1，MuG-1，MaG-2，XJ-1， HJ，NN，TZ-1，其抑制效果均超过50.00%，并且各处理之间差异显著(p<0.05)，其中菌株SL-1抑菌效果最显著，达到77.26%，显著高于其它处理。

表1 初步筛选纯化后的酵母菌

3.2 不同酵母菌对葡萄灰霉菌生长的影响

对初筛得到的10株酵母菌进行复筛。结果见表2(处理5 d后结果)，10株酵母菌对葡萄灰霉菌均有一定的抑制作用。但是对草莓灰霉菌抑制效果超过50%的5株，分别为：SL-1、XJ-1、 L-4、HJ 和MaG-2五株酵母菌，其中SL-1和L-4的抑制效果最显著，分别为66.04%和63.63%，显著高于其它几个处理(p<0.05)其次酵母菌株MaG-2的抑菌效果也比较显著，达到了60.62%；显著低于菌株SL-1和L-4的抑菌效果(p>0.05)，显著高于其余处理(p<0.05)。由此可以看出，从不同材料上得到的酵母菌，抑菌效果差异还是比较大。所以，从更多材料上来分离和筛选有拮抗潜力的酵母菌是其它各项研究和应用的基础。

表2 不同酵母菌对葡萄灰霉菌抑制率测定

3.3 不同酵母菌菌株产挥发性物质对葡萄灰霉菌生长的影响

由于酵母菌还可以产生具有挥发性的物质[10]，因此本研究专门对筛选出既有较好抑制效果的8株酵母菌进行了挥发性物质抑菌效果测定，结果见表3。

表3 酵母菌产生挥发性物质对葡萄灰霉菌生长的影响

从表3可以看出：10株酵母菌株均可以产生挥发性物质且对葡萄灰霉菌有不同程度的抑制效果。其中酵母菌株SL-1和PG-2对葡萄灰霉菌的抑制效果最佳，达到71.56%和68.80%，与其它处理相比，差异显著(p<0.05)。其次为酵母菌菌株XJ-1，对葡萄灰霉菌的抑制率也达到了61.40%。由此可以推测从不同材料上分离得到的酵母菌株均可产生具有抑菌作用的挥发性物质，但是抑制作用差异比较大，这可能不同食材营养物质或者生长环境不同导致在其上生长繁殖的酵母菌株也有所不同，因而产生的挥发性物质的种类和数量也会有较大的差异。

4 结论与讨论

在本研究中，通过对峙培养发现酵母菌株SL-1和L-4的对葡萄灰霉菌菌丝体的抑制效果最显著，分别为66.04%和63.63%；从不同酵母菌菌株产挥发性物质对葡萄灰霉菌生长的影响的实验中发现酵母菌株SL-1和PG-2对葡萄灰霉菌的抑制效果最佳，达到71.56%和68.80%，综合两项实验结果，我们可以得出结论酵母菌株酵母菌株SL-1和PG-2对葡萄采后灰霉菌具有良好的抑制效果，其中以酵母菌株SL-1效果最显著，其次为酵母菌株PG-2。所以，对这两株酵母菌需要进行更深入的研究，例如对生防酵母菌进行鉴定，对其生防机理进行深入研究，对其防治效果进行研究等一系列研究需要开展，通过深入研究有望进一步研究开发成新型生防酵母菌用于葡萄及其它果蔬采后病害的生物防治。