甘露醇和海藻糖对凝血质控品稳定性的影响

谢清泉

【摘 要】：目的：探索甘露醇和海藻糖对凝血质控品稳定性的影响。方法：正常水平Q1由枸橼酸钠抗凝管收集正常人志愿献血后分离得到;异常水平Q2由磷酸盐缓冲液稀释Q1得到。分别向Q1和Q2中添加冻干保护剂甘露醇和海藻糖，配制成凝血质控品。随后考察比较不同组别加速破坏稳定性和复溶稳定性。结果：未添加冻干保护剂凝血质控品，14天加速稳定性和72 h复溶稳定性凝血四项各检测值降幅超过15%;添加1.5%甘露醇凝血质控品，14天加速稳定性和72 h复溶稳定性凝血四项各检测值降幅均在15%以内;添加4%海藻糖凝血质控品，72 h复溶稳定性凝血四项各检测值降幅均在15%以内，但14天加速稳定性不能满足。结论：甘露醇和海藻糖都能明显提高凝血质控品的稳定性，其中甘露醇效果较优;两者组合配制的凝血质控品稳定性均优于伯乐血凝质控品。

【关键词】：甘露醇;海藻糖;凝血质控品;稳定性

【中图分类号】R43【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2020）06-18--01

凝血四项包括凝血酶原时间 （PT）、活化部分凝血活酶时间 （APTT）、凝血酶时间 （TT）、纤维蛋白原 （FIB），属于检验科临检检查项目之一，归属于血栓性疾病检查，为手术前必查项目、血栓前检查项目及监控临床口服抗凝药物患者检查的项目[1]。这就需要临床实验室的检查结果准确可靠，而检测结果会受到多种因素的干扰，这就需要临床实验室开展室内质量控制，以监测和评价本实验室的工作质量，决定常规检验报告是否能发出[2]。而开展室内质量控制就需要质控品，一般每个临床实验室每天需要用质控品监测两次，质控品使用量较大，同时现有的凝血质控品价格较高，且复溶后保存时间较短，这就给实验室带来了巨大的成本压力，如果凝血质控品效期较长及复溶后能保持较长时间，这就会一定程度上缩减实验室的检测成本，因此讨论冻干保护剂对凝血质控品稳定性的影响具有比较重要的意义。为此我们研究了糖类冻干保护剂海藻糖和多元醇类甘露醇对凝血质控品稳定性的影响，以期能获得稳定性好的凝血质控品。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Sysmex全自动血凝分析仪CS-2000i

所用试剂为Siemens凝血酶原时间测定试剂盒 （凝固法），批号：562868;

Siemens活化部分凝血活酶时间测定试剂盒 （凝固法），批号：557279;

Siemens氯化钙溶液，批号：563828;

Siemens凝血酶时间测定试剂盒 （凝固法），批号：48158;

Siemens纤维蛋白原测定试剂盒 （凝固法），批号：547546;

Siemens Owrens巴比妥缓冲液，批号：554632;

Sysmex清洁液 I，批号：A8024;

Bio-Rad Lyphochek Coagulation Control， Level 1，批号：78461;

Bio-Rad Lyphochek Coagulation Control， Level 2，批号：78462;

1.2材料

正常人血浆是由正常人志愿献血，枸橼酸钠采血管收集后分离得到。

1.3方法

1.3.1 凝血质控品Q1和Q2的配制

Q1是由正常人血浆直接添加冻干保护剂冷冻干燥后得到;Q2是由正常人血浆用磷酸盐缓冲液稀释后，添加冻干保护剂冷冻干燥后得到。

1.3.2 加速稳定性

将凝血质控品放到37℃温箱中放置7 d和14 d后，取新开封复溶质控物与稳定期末质控物同时进行检测，重复测定3次，其检测结果的平均值分别记为x0和x，根据公式1计算结果的相对偏差B，要求偏差小于±15%。

公式1：B=（x-x0）/ X0×100%

1.3.3 复溶稳定性

将质控品复溶后在2 ℃～8 ℃下放置24 h和72 h，取新开封复溶质控物与稳定期末质控物同时进行检测，重复测定3次，其检测结果分别计算平均值，根据公式1计算结果的相对偏差。

2 结果

2.1不添加冻干保护剂质控品的稳定性检测

血浆直接配制的Q1和Q2，37℃加速破坏稳定性实验数据见表1，复溶稳定性数据见表2。由表1数据可得：37℃ 加速7天Q1的PT，APTT和TT三个项目的降幅均在45%以上，Q2的PT值已测不出。而我们自己设定的稳定性降幅标准需在15%以内。37℃ 加速14天Q1和Q2稳定性也不能满足要求。由表2数据可得：复溶后24 h Q1和Q2的FIB降幅均已超过15%。以上都表明不添加任何冻干保护剂配制的凝血质控品稳定性较差，需要添加冻干保护剂增加稳定性。

2.2 甘露醇对凝血质控品稳定性的影响

为了验证甘露醇对凝血质控品稳定性的影响，我们分别添加0.5%，1%和1.5%甘露醇配制一批凝血质控品，37℃加速稳定性实验数据见表3，复溶稳定性数据见表4。由表3数据可得0.5%甘露醇37℃加速7天Q2的FIB降幅为16.61%，已超过15%;1%甘露醇37℃加速7天Q1和Q2凝血四项检测值降幅均在15%以内，但14天Q1 FIB降幅为15.66%，超过15%;1.5%甘露醇37℃加速7天14天的Q1和Q2的凝血四项检测值降幅均在15%以内，以上表明随着甘露醇浓度的提高，凝血质控品加速破坏稳定性逐渐提高，且均优于未添加冻干保护剂批次。此外由表4数据可得：1%和1.5%高浓度甘露醇凝血质控品的Q1与Q2的复溶24 h ， 72 h凝血四项检测值降幅均在15%以内，且随着甘露醇浓度的提高，稳定性也逐渐提高，且相比未添加凍干保护剂凝血质控品复溶稳定性也有明显改善。这可能是因为甘露醇作为填充剂，填充在凝血过程相关蛋白和因子之间，从而降低冷冻干燥过程中产生的冻结应力，低温应力和干燥应力对蛋白等的损伤，最终提高了凝血质控品的稳定性

2.3 海藻糖對凝血质控品稳定性的影响

为了验证海藻糖对凝血质控品稳定性的影响，分别添加1%，2%和4%海藻糖配制一批凝血质控品。37℃加速稳定性实验数据见表5，由表5数据可得，虽然各海藻糖浓度的Q1 Q2的37℃加速7天与14天凝血四项检测值降幅未都在15%以内，但相比未添加冻干保护剂批次个别项目检测值达到100%以上，添加海藻糖的凝血质控品稳定性已有明显提高，且随着海藻糖浓度的提高凝血四项检测值降幅越来越低。表明海藻糖在一定程度上能提高凝血质控品稳定性。复溶稳定性数据见表6，由表6数据可得只有4%海藻糖浓度的Q1 Q2的复溶24 h ， 72 h凝血四项检测值降幅均在15%以内，但三个浓度凝血四项个检测值降幅整体上明显低于未添加冻干保护剂批次。再次表明海藻糖在一定程度上能提高凝血质控品稳定性。这可能是因为海藻糖作为冻干保护剂，在冻干过程中与凝血相关蛋白质和因子形成氢键或者填充在蛋白质间，形成空隙支撑蛋白质的结构，从而减少冷冻干燥过程中产生的低温应力，干燥应力和冻结应力对蛋白质造成的损伤，从而提高了凝血质控品稳定性。

2.4 同时添加甘露醇和海藻糖对稳定性的影响

同时1.5%甘露醇和4%海藻糖配制一批凝血质控品，37℃加速稳定性实验数据见表7，由表7数据可得同时添加海藻糖和甘露醇配制的Q1和Q2，37℃加速7天和14天凝血四项各检测值降幅均在10%之间，而伯乐的加速14天Q1的APTT降幅为15.16%，Q2的PT降幅为21.75%，均已超过15%。复溶稳定性数据见表8，由表8数据可得同时添加海藻糖和甘露醇的Q1与Q2复溶24 h和96 h，凝血四项各项检测值降幅均在6%之间，而伯乐的复溶48 h Q2的FIB降幅已达到17.79%。以上表明同时添加1.5%甘露醇和4%海藻糖制备的凝血质控品稳定性均优于伯乐。

3 讨论

开展室内质量控制是保证临床实验室检验结果准确性的基础，而开展室内质量控制需要高成本的质控品，提高质控品的稳定性能在一定程度上降低实验室检测成本。

冻干态的凝血质控品制备过程中需经过冷冻干燥过程，而冷冻干燥过程包括预冻、升华干燥和解吸干燥3 个阶段。整个过程中存在低温应力、冻结应力、干燥应力 （蛋白质表面水分子的缺失） 等，冰晶形成、离子强度增加、pH 值变化等会形成冻结应力，这些应力可能会造成蛋白质失去天然的构象从而失去活性[3-4]。由表1和表2数据可得，未添加冻干保护剂的凝血质控品加速破坏稳定性不能满足7天，复溶稳定性不能满足24 h。这可能就是冻干过程中各种应力对凝血酶等相关蛋白质造成损伤，从而造成酶失去活性，最终造成稳定性差。由表5和表6可得，添加4%海藻糖凝血质控品的复溶稳定性能满足72 h，且加速稳定性凝血四项降幅整体明显低于未添加冻干保护剂批次，添加海藻糖能明显提高凝血质控品稳定性。这可能是因为海藻糖等糖类与凝血相关蛋白质形成氢键或者作为填充剂填充在凝血相关蛋白质之间，从而保护蛋白质免于冷冻干燥过程中产生的各种应力的损伤，维持凝血相关蛋白活性，从而提高凝血质控品的稳定性。之前就有文献报道二糖海藻糖能够与乳酸脱氢酶形成氢键，从而使其稳定[5]。纯海藻糖在30℃高相对湿度时具有优异的性能，能使β-半乳糖苷酶具有长期储存稳定性[6]。此外还有文献报道D-海藻糖使碱性磷酸酶稳定脱水和加热的能力明显优于L-海藻糖，但两种二糖都能为酶提供一定保护[7]。这些都与我们的实验结果相符。由表3和表4数据可得，添加1.5%甘露醇凝血质控品加速破坏稳定性能满足14天凝血四项各检测值降幅均在15%以内，复溶稳定性能满足72 h，稳定性明显高于未添加冻干保护剂批次。这可能是因为甘露醇可能填充在凝血酶等蛋白质之间，维持蛋白质结构，从而维持蛋白活性，最终提高凝血质控品稳定性。之前也有文献报道甘露醇不仅可作为优良的骨架剂使用，而且在还能兼做蛋白质的冻干保护剂[8]。3%甘露醇是重组猪胰蛋白酶理想的冻干保护剂，对于酶活性保留率达 81.3% ～ 101.0%[9]。甘露醇具有低温保护、容易成型以及形成的共晶物熔化温度高等特性，常被用于冻干药品低温保护剂[10]。最终同时添加4%海藻糖和1.5%甘露醇使凝血质控品37℃加速破坏14天凝血四项各项检测值降幅在10%以内，复溶96 h稳定性各项检测值降幅均在6%以内，且优于伯乐凝血质控品稳定性。目前实时稳定性9个月凝血四项各项检测值降幅均在15%以内。至此，我们确定了一种能应用与临床实验室的稳定性较高的凝血质控品配方。这就在一定程度上减少了临床实验室所需质控品数量，从而降低了实验室检测成本。

参考文献

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