超高效液相色谱-串联质谱检测夏枯草片中芦丁的含量

陈骁勇

[摘要]目的 建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定夏枯草片中芦丁含量的方法。方法 采用UPLC-MS/MS法，色谱柱为ACQUITY UPLC RBEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为甲醇-水溶液（47：52），电喷雾离子化（ESI）正离子模式下选择质荷比（m/z）为300.1离子进行检测。结果 所建方法能快速检测夏枯草片中芦丁的含量，在10.78～172.48 ng/ml浓度范围内线性关系良好（r=0.9993），平均加样回收率为99.44%，方法重复性和精密度良好。结论 该方法专属性强，快速灵敏，适用于夏枯草片中芦丁的含量测定。

[关键词]夏枯草片;芦丁;超高效液相色谱-串联质谱

[中图分类号] R284.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）7（b）-0030-04

Content determination of rutin in Xiakucao Tablets by ultra-high performance liquid chromatography-andem mass spectrometry

CHEN Xiao-yong

Department of Pharmacy， Yancheng No.1 People′s Hospital， Jiangsu Province， Yancheng   224000， China

[Abstract] Objective To establish an ultra-high performance liquid chromatography-andem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the content determination of rutin in Xiakucao Tablets. Methods UPLC-MS/MS method was used and the chromatographic column was ACQUITY UPLC RBEH C18 column （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）， the mobile phase was methanol-aqueous solution （47：52）. The mass-charge ratio （m/z） of 300.1 ion was determined by using an electrospray ionization （ESI） in positive ionization mode. Results The established method was able to rapidly detect the rutin content in Xiakucao Tablets with a good linear relationship （r=0.9993） within the concentration range of 10.78-172.48 ng/ml， and the average recovery rate was 99.44%. The method had good repeatability and precision. Conclusion The method has strong specificity， rapid sensitivity and is suitable for the content determination of rutin in Xiabancao Tablets.

[Key words] Xiakucao Tablets; Rutin; Ultra-high performance liquid chromatography-andem mass spectrometry

夏枯草片具有消火、散結、消肿的功效，由中药夏枯草加工制成，主要用于火热内蕴所致的头痛、眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛，临床上常用于甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生病见上述症候者[1-3]。其中主要有效成分为黄酮，目前所采用标准为国家食品药品监督管理局标准YBZ09492008[4]，此标准中采用芦丁与亚硝酸钠-硝酸铝显色，在氢氧化钠碱性条件下测定吸光度，并制备标准曲线法测定黄酮的含量，该方法具有操作繁琐、专属性差、重现性低等缺点，而液质联用系统将超高效液相色谱（UPLC）的高效快速的分离能力和质谱的超高选择性、超高灵敏度的优点结合起来，在中药分析中具有广泛应用[5-6]。本文参照有关文献对芦丁的测定[7-11]，采用高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定夏枯草片中芦丁含量，并进行系统研究，旨在为夏枯草片的质量控制提供实验依据，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料与试剂

芦丁对照品（批号：100080-201610;含量：91.9%），购自中国食品药品检定研究院;去离子水使用超纯水仪自制;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯;夏枯草片样品均为市售产品（规格：20 mg/片，批号：1803N08、20180309、170907、1802051、1704014）。

1.2仪器与设备

Agilent 1290 In finity Ⅱ超高效液相质谱仪[安捷伦科技（中国）有限公司];Agilent 6470 Triple Quad LC/MS/MS串联四极杆液质联用仪[安捷伦科技（中国）有限公司];BP211D电子天平[赛多利斯（上海）贸易有限公司];Merck Milli-Q Advantage A10纯水机[默克化工技术（上海）有限公司]。

1.3方法

1.3.1对照品溶液的制备  精密量取芦丁对照品10.78 mg，置100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释制成每1毫升含107.80 μg的溶液，摇匀，作为对照品贮备溶液。取对照品贮备液，加流动相稀释制成每1毫升约含50 ng的溶液，作为对照品溶液。

1.3.2供试品溶液的制备  取同一批次的夏枯草片20片，精密称定，研细，精密称取0.5 g，置100 ml量瓶中，加流动相适量，超声30 min溶解，放冷至室温，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液适量，加流动相稀释制成每1毫升约含芦丁50 ng的溶液，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.3.3阴性对照溶液的制备  取除夏枯草的其他原辅料，按夏枯草片处方比例，制成阴性对照样品，按“1.3.2”制备供试品阴性对照溶液。

1.3.4色谱条件  色谱柱：ACQUITY UPLC RBEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相：甲醇-水溶液（47∶52），柱温：35℃;流速：0.2 ml/min;进样量：1 μl。分离度良好。

1.3.5质谱条件  采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式，雾化气：45PSI，锥孔电压是4900，干燥气温度：300℃。芦丁的Fragmentor为135;芦丁的m/z为300.1。供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液的色谱图见图1A、B、C，芦丁的二级全扫描质谱图见图1D。

2结果

2.1线性范围

精密量取“1.3.1”项的芦丁对照品贮备液1 ml，置100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 ml置10 ml量瓶中，加流动相分别稀释至刻度，摇匀，滤过，分别取1 μl，按照“1.3.4”项的色谱条件分析，以对照品峰面积比为纵坐标（Y），各对照品浓度为横坐标（X），进行线性回归，得回歸方程：Y=0.1746X+0.02（r=0.9993）。芦丁在10.78～172.48 ng/ml的浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2稳定性试验

取夏枯草片样品（批号：1803N08）1份，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，室温放置于进样室中，分别放置0、2、4、8、12 h，按“1.3.4”项的色谱条件、“1.3.5”项的质谱条件进行测定，记录峰面积，结果显示，峰面积的RSD为0.9%（n=5），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3精密度试验

精密量取“1.3.1”项的对照品溶液，连续6次，按“1.3.4”项的色谱条件、“1.3.5”项的质谱条件进行测定，结果显示，校正因子的RSD为0.5%，表示精密度符合要求。

2.4重复性试验

取夏枯草片样品（批号：1803N08）6份，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.4”项的色谱条件、“1.3.5”项的质谱条件进样测定，计算芦丁平均含量为59.7 mg/片，RSD=1.3%（n=6），表明方法重复性良好。

2.5加样回收率试验

取夏枯草片样品（批号：1803N08）6份（含量为59.7 mg/片），每份约含芦丁10 mg，置100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。精密量取上述溶液各1 ml置另一100 ml量瓶中，精密加“1.3.1”项的芦丁对照品贮备液1 ml，加流动相定容至刻度，依法制备供试品溶液，分别取1 μl，按“1.3.4”项的色谱条件、“1.3.5”项的质谱条件进行测定，按内标法计算含量，结果显示，平均回收率为99.44%，RSD=1.87%（表1）。

2.6检出限与定量限

以信噪比S/N为10测定定量限，计算出芦丁的定量限为0.2 ng/ml。

2.7样品测定

取5批不同批号的夏枯草片，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，平行测定2次，计算样品中芦丁的平均含量。结果显示，批号1802051夏枯草片中的芦丁平均含量最高，为82.3 mg，批号1803N08夏枯草片中的芦丁平均含量最低，为59.7 mg（表2）。

3讨论

夏枯草为唇形科夏枯草属植物，最早载于《神家本草经》，能解内热、缓肝火，治乳痈、乳岩。临床上夏枯草片常用于治疗慢性乳腺炎、甲状腺肿大、急性黄疸型肝炎、乳腺纤维囊性病等病症，对胰腺癌和结肠癌也有一定的抗肿瘤作用[12-15]。

夏枯草中主要活性成分为黄酮类、甾醇类、皂苷类、有机酸类等化合物。黄酮类具有广泛的药理活性，具有保肝、调节免疫、抗病毒杀菌等功效[16-17]。因此夏枯草通常以测定黄酮类成分来控制夏枯草的质量，而芦丁有典型的黄酮类结构，在总黄酮家族中是比较典型的代表物质，因此目前多以芦丁作为黄酮的指标成分[18]。

本文分别选取甲醇、稀乙醇作为流动相，采用回流提取法和超声处理法处理样品，发现流动相超声提取30 min，能完全提取夏枯草片中有效成分，而且操作简便，检测峰形也很好。

芦丁的常用测定方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法，加压毛细管电色谱法、UPLC-MS/MS法等。而UPLC-MS/MS法具有检测限低、专属性强、分析时间快、分离效果好等优点，UPLC-MS/MS法以超高效液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，近年来，UPLC-MS/MS法在中药质量分析中的应用越来越广，因此本文参照有关文献对芦丁的测定[8-10，17-18]，采用UPLC-MS/MS法检测夏枯草片中芦丁的含量，通过线性范围、重复性试验、稳定性试验、精密度试验可以得出，UPLC-MS/MS法检测夏枯草片中芦丁含量的线性关系良好、重复性良好、稳定性高，同时精密度符合要求。同时，本研究结果显示，运用内标法测定6份夏枯草片样品的加样回收率高，说明采用本法的检测限低。本研究结果还显示，不同批号的夏枯草片，测得样品中的芦丁含量差异较大，说明不同批号的夏枯草片含量不等，实验时要注意批号一致性。

本研究实验操作过程中，相比于从前采用的紫外分光光度法，UPLC-MS/MS法操作更加简便。从实验结果分析得出，本研究建立的UPLC-MS/MS测定夏枯草片中芦丁含量的方法，具有专属性强、灵敏度高、分析时间快、分离效果好的优点。

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（收稿日期：2019-12-10）