益生菌体外降解胆固醇的研究进展

陈 霞， 熊智强， 夏永军， 艾连中， 王光强

上海理工大学 医疗器械与食品学院 上海食品微生物工程技术研究中心，上海 200093

世界卫生组织预测，到2030年，心血管疾病仍是导致死亡的主要原因，全球将会有约2.3亿人受到影响[1]。据报道，从1999年到2003年，高胆固醇血症导致西欧45%的心脏病发作，中欧和东欧35%的心脏病发作[2]。目前，有许多体外的研究结果表明微生物具有一定的降胆固醇作用[3,4]，其中益生乳酸菌(主要是乳杆菌和双歧杆菌)的作用较强[5]。例如，从泡菜中筛选出两株植物乳杆菌LpT1和LpT2，其胆固醇去除率分别为49.11%和50.03%[6]。以发酵食品(发酵香肠、酸菜及酸奶)为材料，筛选出一株嗜酸乳杆菌S-59，胆固醇去除率高达69.20%[7]。从健康人群粪便中筛选出五株双歧杆菌，其中，乳双歧杆菌FB001胆固醇去除率最高为67.10%，而FB014的胆固醇去除率只有2.4%[8]。高胆固醇血症患者有望通过长期服用益生乳酸菌及其制品来降低心脑血管疾病的发病率[9]，避免服用降胆固醇药物引起的副作用。

胆固醇是构成细胞的重要成分，对人体发挥重要的生理功能。如果其含量过高也会造成一定的危害，容易引起冠心病、动脉硬化等心脑血管疾病，严重威胁人类的健康[10]。随着人们的生活水平的提高，人们平时饮食摄入的胆固醇量也普遍增加，可以通过调节饮食结构、服用降胆固醇药物、依靠物理/化学方法降低食物中的胆固醇含量等方式降低胆固醇水平，还有依靠一些具有降胆固醇功能的微生物(如益生乳酸菌)，利用其特殊的生理功能研发出新型微生态制剂，使其能够发挥降低机体胆固醇水平的作用，这一措施取得非常显著的效果，而且几乎无任何副作用[11,12]。虽然很多体内实验证实益生菌能有效降胆固醇，但是由于菌株自身的稳定性、菌株之间差异性以及体内生长条件的不同等因素，很难在体内进行机理研究，因此很多学者为方便研究简化体系，常利用体外实验研究其机理，但目前通过体外实验获得很多数据或者假设，但还没有一个统一的结论，有一些甚至相互矛盾，因此亟需进行总结归纳，为后来的研究者提供参考依据。

1 体外降胆固醇作用益生菌概述

1.1 体外降胆固醇益生菌种类

目前，科研人员发现的益生菌大体上可分为：乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等。此外，还有一些酵母[13](如酿酒酵母、发酵毕赤酵母、汉逊德巴利酵母和马克斯克鲁维酵母等)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌Nissle 1917)也可以归入益生菌的范畴。其中，大肠杆菌Nissle 1917是非乳酸益生菌中研究最多的益生菌[14]。

据报道用于体外降胆固醇研究的益生菌菌种如表1所示(不完全统计)。肖晨等人[15]报道植物乳杆菌LH-511和卷曲乳杆菌OF48-2pH5具有较高的体外降胆固醇能力，胆固醇降解率分别为57.50%和41.90%。嗜酸乳杆菌S-59和鼠李糖乳杆菌DM9054胆固醇降解率分别为69.20%和55.48%[7,16]。韦云路等人[17]研究的动物双歧杆菌LPL-RH、长双歧杆菌 TTF和植物乳杆菌LPL-1的体外胆固醇去除率分别为23.80%、24.50%、20.90%，三者之间没有显著性差异。王秀娟等人[18]研究2株益生菌保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的体外降胆固醇能力，优化高效降胆固醇的条件，发现按2%接种量，培养基的pH为6.7，37 ℃培养48 h后，降胆固醇效果最好，胆固醇的降解率分别为4.12%和4.53%。还有的研究表明，与嗜热链球菌相比，嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌是具有高效同化胆固醇能力的菌株，可用于降低食品中的胆固醇[19]。国立东等人[20]研究乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201的体外降胆固醇特性，该菌株能够从培养基中去除33.10%胆固醇，其中发生共沉淀作用去除14.30%的胆固醇，菌体细胞吸收18.10%的胆固醇到细胞内。植物乳杆菌YXB23和乳酸片球菌YDA12，降解率分别为35.33%和33.53%[21]。何永岩等人[22]研究的5株益生菌从培养基中去除胆固醇都在27.00%以上，粪肠球菌L14-3为35.90%，乳酸乳球菌L14-3为35.90%。从泡菜汁中分离得到3株链球菌株(D1、D4和D6)和3株明串珠菌株(D2、D3和D5)，6株菌株都具有降胆固醇特性，其中D1培养48h的胆固醇降解率高达81.57%，可应用于发酵食品的生产[23]。张灏等人[24]研究的15株植物乳杆菌，能够不同程度的降低培养基中的胆固醇，胆固醇降解量从0.00 μg/mL～90.50 μg/mL。嗜酸乳杆菌CH1和干酪乳杆菌MUH117没有降低培养基中的胆固醇[25]。BELVISO等人[26]的研究中发现6株植物乳杆菌和2株副干酪乳杆菌完全没有降低培养基中的胆固醇。此外，有研究发现酿酒酵母K11、发酵毕赤酵母K14、汉逊德巴利酵母H2和马克斯克鲁维酵母Z17，大肠杆菌Nissle 1917和凝结芽孢杆菌MTCC 5856都有降胆固醇的能力[13-14,27]。

体外研究表明益生乳酸菌中乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、乳球菌属、片球菌属、芽孢杆菌属和明串珠菌属都包含降胆固醇特性的菌株，其中关于乳杆菌属和双歧杆菌的报道较多；一些酵母[13](酿酒酵母K11、发酵毕赤酵母K14、汉逊德巴利酵母H2和马克斯克鲁维酵母Z17)和非乳酸益生菌[14](大肠杆菌Nissle 1917)也具有降胆固醇的能力，但是它们的降胆固醇能力存在一定差异。还有一些菌株没有降解胆固醇的能力，如嗜酸乳杆菌CH1、干酪乳杆菌MUH117、植物乳杆菌ST1003等。对于具有降解胆固醇活性的益生菌菌株而言，不同菌种具有不同的降胆固醇能力，即使同属于乳杆菌属中的植物乳杆菌，其降胆固醇的能力也存在很大差异，因此胆固醇的去除也具有菌株特异性。

表1 被报道的具有降胆固醇能力的部分益生菌菌种

1.2 影响益生菌体外降解胆固醇作用的因素

1.2.1胆汁盐的种类与浓度的影响

有研究发现菌株在含有胆盐的培养基中具有更高的降胆固醇活性。在LE B 和YANG S H的研究中，与不含0.3% (w/t) oxgall相比，植物乳杆菌FB003、鼠李糖乳杆菌GG和戊糖片球菌KACC 12311在含有0.3% (w/v) oxgall的条件下，3株菌的降胆固醇能力均显著提高了1.5倍[43]。吕兵等人[45]研究了从Kefir中分离得到的植物乳杆菌的降胆固醇能力与胆盐之间关系，发现植物乳杆菌在不含胆盐的培养基中几乎没有降胆固醇能力，而在添加胆盐(3 g/L TCA)后能够从培养基中去除60%的胆固醇，其中共沉淀50%的胆固醇，菌体吸收10%的胆固醇；随后设置TCA浓度梯度研究胆盐浓度与降胆固醇能力的关系，发现胆盐浓度在0～4 g/L范围内，上清液中胆固醇含量随着胆盐浓度的增加而减小，但胆盐浓度超过4 g/L时胆固醇的含量又会增加；沉淀洗涤液中胆固醇含量呈现先增加后减小的趋势。此外，还有研究中发现干酪乳杆菌Shirota在含有0.4% oxgall的培养基中胆固醇的吸收量增大，与0.2% oxgall相比具有显著性意义，而对于短乳杆菌NR1C1684、植物乳杆菌NDV和发酵乳杆菌F53等菌株无显著性意义[3]。培养基中oxgall的浓度影响嗜酸乳杆菌NCFM的降胆固醇能力，上清液中胆固醇含量随着oxgall浓度的增加而减少，在oxgall 浓度为0.4% 时降解胆固醇能力最强[46]。发酵乳杆菌KC5b分别在6种胆盐中的胆固醇去除率从2.8%(oxgall)提高到53.6%(DCA)，通过分析在oxgall、TCA、GCA和TDCA中胆固醇去除率无显著差异，而在CA和DCA中差异显著[40]。从Kefir中分离的一株植物乳杆菌在含有TDCA(72%)、TCA(60%)、GDCA(54%)和GCA(39%)的培养基胆固醇去除率也是不同的[45]。因此，一些菌株在含有胆盐时降胆固醇能力比不含胆盐时的高，并且因胆盐种类和浓度的不同而产生差异。但由于菌株自身特性、胆盐耐受性等的不同，胆盐浓度与降胆固醇能力之间并没有明显的相关性。

1.2.2菌株的种类及其不同生长阶段的影响

目前，有很多研究报道了益生菌菌株的降胆固醇作用，发现不同的益生菌菌株的降胆固醇作用具有差异性[47]。益生乳酸菌是一类庞大且复杂的细菌，目前超过200个种。不同的益生菌菌株或同一菌株不同生长阶段，其降胆固醇效果也不同[48]。BELVISO等人[26]的研究中，2株植物乳杆菌降胆固醇含量平均为19.40%，而3株副干酪乳杆菌降胆固醇含量平均为6.80%。唐雅茹等人[30]的研究中，植物乳杆菌KLDS1.0386降解胆固醇能力高达55.71%。林斌等人[49]的研究表明植物乳杆菌HLX37在6 h、12 h、24 h和48 h均具有降解胆固醇的能力，并且其降胆固醇能力随着培养时间的延长而逐渐提高，到48 h胆固醇去除率达最大值。这和刘娟等人的研究结果一致，菌体的不同生长阶段对降胆固醇能力有着很大影响[3,50-51]。因此，影响菌株的胆固醇的去除不仅与菌株的种类有关，而且还与菌株的生长阶段有关，菌株生长量导致降胆固醇能力也不同[3]。

1.2.3pH的影响

很多研究结果表明胆固醇的去除与培养基的pH有关[25]。在不控制pH值的条件下，两株干酪乳杆菌N19和E5从培养基中去除胆固醇的量分别为36.3 mg/mL和56.6 mg/mL。但是在控制pH(6.0)的条件下，两株菌的胆固醇去除量都很小，分别为10.4 mg/mL和8.0 mg/mL，二者之间呈现显著差异[52]。从Kefir中分离的一株植物乳杆菌在恒定pH(6.0)时胆固醇含量减少了0.02 mg/mL；而在自然pH时胆固醇含量减少了0.18 mg/mL[45]。而在另一项研究中呈现与之矛盾的观点，植物乳杆菌ST-III在不控制pH的条件，菌株从培养基中去除胆固醇的量为0.112 mg/mL,其中沉淀0.041 mg/mL的胆固醇，同化0.071 mg/mL的胆固醇；在控制pH为6.0的条件下，菌株从培养基中去除胆固醇的量为0.132 mg/mL，其中沉淀0.029 mg/mL的胆固醇，同化0.103 mg/mL的胆固醇。张玢研究了不同pH(pH在3.0～7.0之间)对植物乳杆菌KF5降解胆固醇的影响，结果表明胆固醇降解率随pH的升高先增加后减小，以pH 5.0为分界点，此时降解率最高达到34.65%，而pH 3.0降解率最低(5.94%)，可能是因为过低的pH抑制菌株的生长[53]。这表明一些菌株降胆固醇能力与菌株生长过程中培养基的pH有关。但对于不同的益生菌菌株，培养过程维持pH稳定机制以及pH的变化是不同的，那么降胆固醇能力就具有菌株特异性。

1.2.4胆盐水解酶的作用

体外的研究表明，益生菌产生的胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)可将甘氨酸和牛磺酸等结合型胆汁酸盐水解生成游离胆汁酸和氨基酸残基，再通过胆固醇与游离胆汁酸、菌体细胞形成复合物发生共沉淀作用去除培养基中的胆固醇。目前，具有BSH活性的细菌主要有乳杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属等。TAHRI等人[54]研究嗜酸乳杆菌RP32分别在酸化和pH控制在6.0的条件下培养，都观察到胆盐的完全去除，只有在胆盐去结合作用后才能观察到明显的胆盐沉淀。并且在酸化条件下去结合胆盐的沉淀程度(50%)高于pH控制的条件下(30%)，胆固醇与胆盐发生共沉淀，而在pH控制的对照培养基中未发现胆固醇的沉淀。在没有细菌细胞的情况下，胆固醇是由于去结合胆盐的溶解度降低而沉淀的。这表明菌株嗜酸乳杆菌RP32从培养基中去除的胆固醇不是由于细菌细胞对胆固醇的吸收，而是由于细菌的胆盐水解酶对结合胆盐的去结合作用所致，使胆固醇发生共沉淀[25]。TARANTO等人[55]的研究也发现罗伊氏乳杆菌体外清除胆固醇的主要机制与细胞的BSH活性有关，释放去结合的胆汁酸(在低pH值下不易溶解)，诱导胆固醇沉淀。在另一项体外研究也评价了BSH在植物乳杆菌80(pCBH1)中的降胆固醇作用[56]。但是有的研究表明BSH的作用与益生菌降解胆固醇之间没有相关性。鸡乳杆菌I 16、I 26和兔乳杆菌C17具有较高的去结合胆盐活性却不能去除培养基中的胆固醇，在这些菌株中胆固醇去除与胆盐去结合之间没有相关性[57]。酿酒酵母K11、发酵毕赤酵母K14、汉逊德巴利酵母H2和马克斯克鲁维酵母Z17以及大肠杆菌Nissle 1917等菌株的降胆固醇并非BSH的参与，可能还存在别的降胆固醇机制[14]。

1.2.5其他因素

除了上述的影响因素外，不同的培养基、游离胆汁酸的量和添加益生元等也会影响益生菌菌株的降胆固醇能力。植物乳杆菌HLX37在MRS、MRS+1 g/L TCA、MRS+Cholesterol和MRS+Cholesterol+1 g/L TCA培养基中均具有降解胆固醇作用，在MRS+Cholesterol+1 g /L TCA培养基中培养48 h胆固醇降解能力最强[49]。植物乳杆菌C8能够降解甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠和混合胆盐，在含有甘氨胆酸钠的条件下，胆固醇去除率最高，同时测得的游离胆汁酸生成量也最多，然后是混合胆盐和牛磺胆酸钠。它们的胆固醇去除率与游离胆汁酸生成量成正比关系[58]。7中益生元都能够促进植物乳杆菌KF5的降解，添加聚葡萄糖与对照相比，胆固醇降解率提高了6.56%[53]。LIONG等人[59]研究了在6种益生元存在的培养基中，干酪乳杆菌ASCC 292对胆固醇的去除作用，通过响应面分析添加多种益生元更有助于胆固醇的降解。

综上所述，益生菌降胆固醇的能力受到多种因素的影响，其影响方式因菌株和菌种的不同而异。

2 益生菌体外降胆固醇的机制研究进展

许多体外研究已经报道益生菌降解胆固醇作用的一些机制，包括(1)胆固醇掺入菌体的细胞膜/壁[3,60]；(2)菌体含有的胆盐水解酶(Bile salt hydrolase，BSH)使结合胆盐发生去结合作用，生成游离胆酸与胆固醇发生共沉淀作用的共沉淀理论[61]；(3)菌体直接吸收胆固醇的吸收理论[62]；(4)其他理论：除共沉淀和吸收作用等非代谢途径外，还存在着复杂的代谢降解机制[50]。此外，还有研究表明同化作用和共沉淀作用共同起作用[63]。

2.1 胆固醇掺入/粘附菌体的细胞膜(壁)

根据体外实验结果，证明了胆固醇的去除量与胆盐的去结合作用二者之间没有相关关系，因此推测出另外一种降胆固醇理论，胆固醇掺入/粘附细胞膜(壁)上来去除培养基中的胆固醇[64]。例如，嗜酸乳杆菌ATCC 43121可以将生长过程中从培养基中的去除的部分胆固醇合并到细胞膜中[65]。KIMOTO等人[66]的研究中将活细胞和生长细胞与休眠细胞(活细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中)和死细胞(热死细胞)进行比较，与死亡的细胞相比，虽然生长中的细胞能够清除更多的胆固醇，但是热致死的细胞仍然可以清除培养基中的胆固醇，这表明一些胆固醇的去除是通过与细胞表面结合在一起的。USMAN和HOSONO研究的28株加氏乳杆菌菌株都具有结合胆固醇的能力，但不同菌株之间的结合能力存在显著差异，但是目前还不清楚是由于细胞膜的差异还是其他细胞成分的差异引起的[39]。其中SBT10241、SBT10240、SBT10238等菌株可以通过与细胞表面结合来去除培养基中的胆固醇，此外还研究了不同浓度的乙醇对粘附性的影响，发现粘附在细胞上的胆固醇随着乙醇浓度的增加而减小。TARANTO等人[55]对罗伊氏乳杆菌CRL 1098的细胞壁/膜和细胞质液进行了评估，发现大约有20%最初添加的[3H]胆固醇在壁/膜部分中被检测到，并且菌体沉淀的胆固醇在pH 7.0磷酸钠缓冲液下洗涤后没有分离，充分说明20%的沉淀胆固醇掺入到菌体的细胞膜/壁上。

2.2 共沉淀理论

KLAVER和VAN DER MEER[25]通过对多株双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的体外实验，提出了胆固醇的共沉淀作用，游离胆汁酸能够在酸性条件(pH<5.5)下共沉淀胆固醇，而在偏中性条件下，这种共沉淀作用会减弱。汤慧勤等人[67]对5株产BSH的植物乳杆菌降胆固醇作用进行分析，测定发酵上清液、菌体洗涤液和菌体破碎液三部分胆固醇含量，进一步验证了是BSH水解结合胆盐生成的游离胆汁酸与胆固醇的共沉淀作用。乳酸乳球菌乳亚种HUCM201从培养基中去除胆固醇的机制之一是由BSH引起的共沉淀作用，并且发现其对甘氨胆酸钠的水解作用更强，在共沉淀作用中发挥重要作用[20]。在pH 3.5和pH 4.0的条件下，通过游离胆汁酸与胆固醇的共沉淀曲线，发现共沉淀胆固醇的量随着胆汁酸浓度的升高而增加[68]。

2.3 吸收理论

一些体外研究结果表明，益生菌在含有胆盐和胆固醇的培养基中厌氧培养时，菌体细胞能够吸收胆固醇，达到从培养基中去除胆固醇的作用。菌体吸收胆固醇能力依赖于其生长特性，并且胆盐的存在是菌体细胞吸收胆固醇的前提条件。TAHRI等人[37]通过对双歧杆菌的生长细胞和静息细胞进行了体外降胆固醇的实验，发现生长细胞能吸收6%～50%不等的胆固醇，而休眠细胞则没有。用放射性标记检测发现酯化的胆固醇能够被双歧杆菌吸收，但酯化的胆固醇不会与游离胆盐发生共沉淀作用，这充分说明胆固醇确实被菌体细胞所吸收了。在KIMOTO等人[66]的研究中，7株乳球菌菌株都能够从含有牛磺胆酸钠和胆固醇的培养基中去除胆固醇，一方面乳球菌菌株没有从牛磺胆酸钠中产生牛磺酸，表明乳球菌去除胆固醇与游离胆盐对胆固醇的沉淀无关；另一方面生长细胞去除胆固醇的能力高于静息细胞和热杀死细胞，表明培养基中的胆固醇是通过菌体细胞吸收作用去除的。

2.4 其他理论

益生菌体外降胆固醇机制除共沉淀和吸收作用等非代谢途径外，还存在着复杂的代谢降解机制。代谢降解机制可能是益生菌菌株处于生长状态时产生特殊的酶，将胆固醇降解并转化为其他物质，这部分可以通过代谢组学和蛋白质组学来进一步分析。植物乳杆菌菌株LpT1和LpT2在三种培养基中的上清液、沉淀和破碎细胞中的胆固醇含量总和与未接种的空白培养基中的胆固醇含量0.1 mg/mL相比，二者不相等，可以看到6组都有部分胆固醇“消失”，其中菌株LpT2在含有胆固醇的MRS培养基中总胆固醇含量为0.045 mg/mL远远小于对照的0.1 mg/mL，这可能是由于菌体细胞利用胆固醇并转化成其他物质[69]。益生菌体外降胆固醇不仅仅是一种机制起作用，而是多种机制一起发挥作用的，以菌体同化作用和共沉淀作用为主要作用机制。

3 结论

益生菌被广泛用于评估其对降胆固醇的作用，然而其作用效果因菌株和菌种的不同而产生差异。有一些益生菌菌株表现出降胆固醇的特性，而另一些则没有。值得注意的是具有高BSH活性的菌株却没有降胆固醇能力，为具有高降胆固醇能力益生菌的筛选增加难度。通过体外研究揭示益生菌对降低胆固醇的作用机制有多种，但对于不同菌株仍然存在争议。因此，后续需要通过一系列实验来进一步验证并完善其降低胆固醇的机制。