布比卡因通过调节AMPK对人膀胱癌T24细胞恶性增殖、氧化应激及凋亡的影响

陈明明，司马靓杰，刘巍巍，张宜林

(河南科技大学第一附属医院麻醉科，河南 洛阳 471003)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在男性的恶性肿瘤中排名第6[1-3]。我国膀胱癌的发病率和死亡率逐年快速上升[4-5]。尽管在过去的10年中，癌症的治疗方式(包括手术、放射疗法和化学疗法)得到了明显改善，但膀胱癌患者的预后并未得到显著提高[6-9]。 因此，迫切需要寻找新的治疗药物和治疗靶标以改善该疾病患者的预后。最近的研究表明，局部麻醉药可能在癌症治疗中发挥有益作用，能够抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移[10]。布比卡因是广泛用于长期、局部和区域麻醉的麻醉药[11]。研究已证实布比卡因可诱导前列腺癌细胞的凋亡和抑制胃癌的发生[12-13]。但探讨局部麻醉剂对软骨形成肿瘤影响的研究较少。本研究探讨布比卡因对人膀胱癌T24细胞增殖、氧化应激和凋亡的影响及其机制，以期为布比卡因应用于治疗膀胱癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

布比卡因(百奥莱博科技有限公司，中国)；DMEM培养液、胎牛血清、胰酶(Invitrogen公司，美国)；二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒 (PIERCE公司，美国) ；MatrigelTM底膜基质 (BD公司 ，美国) ；Caspase-3、Bax、Bcl-2、 Ki67、AMPKα1抗体 (Sigma公司，美国)；HRP标记的山羊抗鼠二抗(Santa Cruz公司，美国)；细胞凋亡检测试剂盒 (Annexin PE/7-AAD，南京凯基生物有限公司,中国) ；Transwell小室及人工基底膜 (BD公司 ,美国) ；高速低温离心机(Beckman公司，美国)；CO2培养箱(Thermo公司，美国)；Mini-PROTEAN Tetra电泳槽、Powerpac电转仪(Bio-Rad公司，美国)；FACS Vantage SE 流式细胞仪(BD公司，美国)；凝胶成像系统GDS-800 UVP (UVP公司)。

1.2 细胞培养

T24细胞在含有10%(φ)胎牛血清的DMEM培养基中生长，置于5%(φ)CO2的培养箱中37 ℃培养。细胞汇合率达到85%以上时用0.25%胰酶进行消化传代。

1.3 CCK8检测细胞存活率

选择不同剂量(0、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、25、50、100 mmol/L)的布比卡因处理胶质瘤T24细胞，将处理后的U-87细胞传代培养于96孔板中，培养24 h后对细胞进行相应转染后，根据试剂盒说明书每孔加入10 μL CCK8试剂并于培养箱中继续孵育2 h，用酶标仪检测各组吸光度(A)，绘制折线图并计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组吸光度/对照组吸光度)×100%。

1.4 克隆形成实验检测细胞增殖

将T24细胞随机分为4组，分别用0、1.25、2.5、5 mmol/L的布比卡因处理T24细胞。48 h后，细胞移入6孔板，每孔1 000个细胞，孵育10 d。在培养过程中每3天更换1次新鲜的完整培养基。然后将细胞菌落用4%(φ)多聚甲醛固定15 min，吸取多聚甲醛弃掉，加入1 mL/孔0.1%结晶紫孵育15 min,PBS洗涤3次。记录细胞克隆数，并在显微镜下观察。

1.5 RT-PCR检测增殖标记物的表达

使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过超微紫外光分光光度计在260和280 nm处测定吸光度。 按照试剂盒说明书，使用Super RT cDNA试剂盒合成cDNA。 此外，使用Quantifast®SYBR®GreenPCR Kit进行PCR，分别在95 ℃ 15 s 和60 ℃ 60 s条件下使用ABI 7500将反应激活。用于该反应的Ki67、Survivin和GAPDH的引物序列见表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

取处理过的T24细胞，以1×106个/孔的细胞量接种至6孔板中，置37 ℃、5%CO2孵箱中孵育72 h。分别收集每个孔内的细胞。按凋亡检测试剂盒说明书操作，用Annexin V-FITC和pro-pidium iodide (PI) 双染法在流式细胞仪上进行细胞凋亡检测，使用FlowJo软件进行数据分析。

1.7 试剂盒检测SOD的活性和MDA、GSH的水平

取处理过的T24细胞，分别采用SOD、MDA、GSH试剂盒测定SOD、GSH活性及MDA的含量。操作步骤严格按照大鼠SOD、MDA、GSH试剂盒说明书进行。另外，为验证布比卡因是否通过AMPK来影响细胞增殖、氧化应激及凋亡，本研究引入AMPK抑制剂Compound C(CC)，将T24细胞分为4组：0 mmol/L组、5 mmol/L组布比卡因、CC组和5 mmol/L布比卡因组+CC组，检测SOD活性。

1.8 免疫印迹法

取处理过的T24细胞，使用裂解缓冲液裂解细胞样品。然后使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime)定量蛋白质浓度。含有20 mg蛋白质的样品在10%SDS-PAGE中分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗 (Caspase-3,1∶1 000; Bax,1∶1 000; Bcl-2,1∶1 000; Ki67,1∶1 000; AMPKα1,1∶1 000)于4 ℃封闭过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL,设置曝光参数，检测目的条带对应化学发光强弱。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度的布比卡因对T24细胞活力的影响

如图1所示，不同剂量布比卡因处理人膀胱癌T24细胞24 h后，与0 mmol/L组比较， 0.313、0.625、1.25、2.5、5 mmol/L组的T24细胞存活率无显著变化(P>0.05)；10、25、50、100 mmol/L组的T24细胞存活率以布比卡因浓度依赖的方式显著降低(P<0.05)，表现出明显的细胞毒性。

与0 mmol/L组比较：*P<0.05。

2.2 布比卡因对T24细胞增殖的影响

如图2所示，与0 mmol/L组比较，1.25 mmol/L布比卡因组的细胞克隆形成率无显著变化(P>0.05)，而 2.5 mmol/L和5 mmol/L组的克隆形成率呈剂量依赖性显著减少(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。A. 克隆形成实验(200×)；B. 克隆形成实验的直方图。与0 mmol/L组比较：*P<0.05。

2.3 布比卡因对T24细胞Ki67和 Survivin的mRNA水平的影响

如图3所示，与0 mmol/L组比较，1.25 mmol/L组的Ki67和Survivin的mRNA水平无显著变化(P>0.05)；2.5 mmol/L和5 mmol/L组的Ki67 mRNA和Survivin mRNA水平呈剂量依赖性显著降低(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。与0 mmol/L组比较：*P<0.05。

2.4 布比卡因对T24细胞凋亡的影响

如图4所示，与0 mmol/L组比较，1.25 mmol/L组的细胞凋亡率无显著变化(P>0.05)；2.5 mmol/L和5 mmol/L组的细胞凋亡率呈剂量依赖性显著升高(P<0.05)。

A.细胞凋亡分布图； B.细胞凋亡情况直方图。与0 mmol/L组比较：*P<0.05。

2.5 布比卡因对凋亡相关蛋白表达的影响

如图5所示，与0 mmol/L组比较，1.25 mmol/L组的Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白表达比例无显著变化(P>0.05)；2.5 mmol/L和5 mmol/L组的Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白表达比例呈剂量依赖性显著升高(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。A.蛋白印迹实验； B.蛋白印迹实验的直方图。与0 mmol/L组比较：*P<0.05。

2.6 布比卡因对SOD活性、GSH和MDA含量的影响

如图6所示，与0 mmol/L组比较，1.25 mmol/L组的SOD和GSH含量无显著变化(P>0.05)，2.5 mmol/L和5 mmol/L组的SOD和GSH含量呈剂量依赖性显著降低(P<0.05)；而1.25 mmol/L组的MDA含量无显著变化(P>0.05)，2.5 mmol/L和5 mol/L组的MDA含量呈剂量依赖性显著升高(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。A. SOD活性； B. MDA含量； C. GSH含量。与0 mmol/L组比较：*P<0.05。

2.7 布比卡因对AMPK水平、T24细胞增殖、氧化应激以及凋亡的影响

如图7(A)所示，与0 mmol/L组比较，1.25 mmol/L布比卡因组的AMPK蛋白水平无显著变化(P>0.05)，2.5 mmol/L和5 mmol/L组的AMPK蛋白水平呈剂量依赖性显著升高(P<0.05)，表明布比卡因可促进AMPK的表达。如图7(B)所示，与0 mmol/L组比较，5 mmol/L组SOD活性显著降低(P<0.05)，CC组SOD活性显著升高(P<0.05)；而与CC组比较，5 mmol/L布比卡因组+CC组SOD活性显著降低(P<0.05)。如图7(C)(D)所示，与0 mmol/L组比较，5 mmol/L组AMPKα1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Ki67蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比例显著升高(P<0.05)；CC组AMPKα1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Ki67蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比例降低(P<0.05)。与CC组比较，5 mmol/L组+CC组AMPKα1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Ki67蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比例显著升高(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因; 5. 抑制剂Compound C; 6. 抑制剂Compound C+5 mmol/L布比卡因。A. AMPKα1的蛋白表达； B. SOD活性； C.引入抑制剂后AMPKα1、Ki67和Caspase-3的蛋白表达； D.引入抑制剂后AMPKα1、Ki67和Caspase-3的蛋白表达直方图。与0 mmol/L组比较：*P<0.05；与CC组比较：#P<0.05。

3 讨论

局部麻醉药的作用范围很广，越来越多的证据表明，局部麻醉剂对各种不同类型的细胞都是有毒的[14-15]。布比卡因是使用最广泛的局部麻醉药之一，据报道布比卡因对多种软骨瘤细胞均有毒性，布比卡因导致细胞活力呈剂量和时间依赖性显著降低[16]。本研究通过不同剂量布比卡因处理人膀胱癌T24细胞24 h后，T24细胞的存活率以布比卡因浓度依赖的方式降低。因此，本研究选择无显著毒性的布比卡因剂量 (0、1.25、2.5、5 mmol/L) 进行后续实验。

癌细胞无限增殖是癌症发生发展的重要机制。有报道称，在一定浓度范围内布比卡因可诱导卵巢癌和前列腺癌细胞死亡，并抑制结肠癌和胰腺癌细胞的增殖[12,17]。研究发现布比卡因可显著减少呈Ki67阳性核染色的Caco-2细胞数量，抑制结肠癌细胞的增殖[17]。同样，Xuan等[12]证实布比卡因治疗能使SKOV-3和PC-3细胞中Ki-67阳性细胞减少，抑制卵巢癌和前列腺癌细胞增殖。本研究结果显示，布比卡因处理后膀胱癌T24细胞克隆形成率降低，Ki67 mRNA和Survivin mRNA的表达降低，提示布比卡因能够抑制膀胱癌T24细胞恶性增殖。

诱导细胞凋亡是抑制肿瘤生长的主要手段之一[18]。研究发现随着布比卡因浓度的增加和暴露时间的延长，所有肿瘤组的凋亡细胞数量均有所增加[16]。Chang等[19]在体外研究中发现布比卡因能有效诱导人乳腺肿瘤细胞凋亡。同样地，用布比卡因治疗人甲状腺癌细胞会导致细胞活力下降和菌落形成。这种治疗通过线粒体损伤和丝裂原活化蛋白激酶的激活诱导细胞凋亡[20]。本研究结果显示，布比卡因处理膀胱癌T24细胞后，Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白表达比值和细胞凋亡率均升高，提示布比卡因可诱导膀胱癌T24细胞凋亡。

GSH和SOD是细胞内抗氧化剂，MDA是脂质过氧化的指标，均在细胞氧化应激中起重要作用[21-22]。由于清除活性氧的损害，GSH的消耗导致氧化损伤[23]。SOD可以中和自由基，保护细胞免受活性氧损伤[24]。研究发现布比卡因通过降低SOD活性和GSH含量，增加MDA含量，诱导SH-SY5Y细胞的氧化损伤[25]。本研究结果显示，布比卡因处理膀胱癌T24细胞后SOD活性和GSH含量降低，MDA含量升高，结果提示布比卡因可诱导膀胱癌T24细胞氧化应激。

AMPK被认为是细胞能量稳态的调节因子，通过它感知细胞内的代谢状态，特别是在ATP缺乏的情况下，并且与细胞应激的调节有关[26]。最近研究表明AMPK可能参与了布比卡因诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的细胞毒性[27]。本研究发现布比卡因通过上调AMPKα1蛋白表达水平，降低Ki67蛋白表达水平和SOD活性，上调Cleaved Caspase-3/Caspase-3的蛋白表达比值，提示布比卡因可通过上调AMPK水平抑制人膀胱癌T24细胞恶性增殖并诱导细胞氧化应激和凋亡。

综上所述，布比卡因可通过上调AMPK水平抑制人膀胱癌T24细胞恶性增殖并诱导细胞氧化应激和凋亡，为布比卡因应用于临床治疗膀胱癌提供了实验依据。