黄花菜花粉生活力鉴定和萌发率测定方法研究*

张 琨 殷丽丽 韩志平 陈枝文 王一衡

（1.山西大同大学生命科学学院，山西大同大学设施农业技术研发中心，山西 大同 037009；2.天津市农业科学院生物技术研究所，天津 西青 300384）

黄花菜（Hemerocallis citrinaBaroni）属百合科萱草属，为我国一种药食同源的特色蔬菜[1]。我国是世界上黄花菜种质资源最丰富的国家，现有黄花菜品种60余种[2]。由于黄花菜不同品种间的形态差别不大，加之长期进行无性繁殖，缺乏新的优良基因的融合，使品种间的遗传差异不断缩小，品种退化日益凸显。

杂交是作物育种的主要手段，虽操作简单，但结实率较低，很难获得成功。花粉生活力强弱是决定杂交成功与否的关键。明确黄花菜花粉生活力的测定方法及测定标准，对选育杂交新品种非常重要。近几年对黄花菜的研究主要集中在栽培管理技术、组织培养快繁、加工保鲜工艺及功能成分分析等方面[3～6]，对其花粉生活力的研究不够系统。目前花粉生活力测定方法主要有两种，即染色法和花粉离体萌发法。染色法因方便快捷、操作简单，被广泛应用于不同植物的花粉检测；花粉离体萌发法检测花粉生活力最准确，花粉离体萌发能力是判断花粉生活力最有效的指标[7]。大量研究表明，培养基中蔗糖、硼酸等主要成分对花粉萌发及花粉管伸长具有不可替代的重要作用[8]。蔗糖是供给花粉离体萌发最重要的能量物质，其浓度决定了花粉离体萌发的成败。本研究以黄花菜为材料，比较不同染色法的染色效果和不同蔗糖浓度对黄花菜花粉离体萌发的影响，以期筛选出快速而准确的黄花菜花粉生活力测定方法，为黄花菜人工授粉及品种改良提供最佳的工作方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄花菜品种为大同花。大同花黄花菜于2015年引种于山西大同大学生命科学学院实验基地，田间管理措施按常规。2019 年9 月植株盛花期开始，每天于晴天上午8～10 时从生长良好、无病虫害的黄花菜植株上采摘即将开放的花蕾带回实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉染色剂筛选

取现采的花蕾，将花药连同花丝拔下，用镊子抖动离花药较近的花丝，使花粉落至载玻片的中央，分别使用1%醋酸洋红、1%亚甲基蓝和0.5%氯化三苯基四氮唑（TTC）对黄花菜花粉常温染色15 min。记录不同处理的染色结果，筛选出适宜的花粉染色剂。每个处理3次重复，每个重复进行3个视野的观察。

1.2.2 染色时间研究

取现采的花蕾，将花粉抖落至载玻片的中央，滴加1～2 滴筛选出的染液。设置6 个染色时间，分别为10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min。常温培养完成染色后，用显微镜观察各染色时间处理花粉的染色结果，计算染色率[9]，筛选出最佳的花粉染色时间。每个处理3次重复，每个重复进行3个视野的观察。

1.2.3 不同蔗糖浓度下黄花菜花粉萌发率测定

采用液体培养法，在300 mg/L硼酸加50 mg/L氯化钙的基本培养基上[10～11]设置6个蔗糖浓度梯度，分别为0 g/L、30 g/L、60 g/L、90 g/L、120 g/L、150 g/L。将花粉抖落在载玻片的中央，滴加2 滴配制好的培养基，将载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中常温培养6 h，然后制成压片进行显微观察。每个处理3 次重复，每个重复进行3个视野的观察。花粉萌发以花粉管长度超出花粉粒直径为判断依据[12]，计算萌发率。

1.3 数据分析

利用SPSS 24.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同染色剂对黄花菜花粉活力测定结果的影响

黄花菜花粉染色显微观察结果如图1所示。醋酸洋红染色下，花粉粒均被染为鲜红色，在显微镜下差异极小，无法判断花粉活性（图1a）；用TTC 染液染色的花粉，花粉粒均被染为暗红色，在显微镜下差异也不明显（图1b）；当使用亚甲基蓝染色时，在显微镜下观察到有活力的花粉被染成了蓝色，而丧失活力的花粉则没有着色，显微镜下差异显著，效果明显（图1c）。由此可见，醋酸洋红染液和TTC 染液不宜用于测定黄花菜花粉生活力，亚甲基蓝较适宜用于测定黄花菜花粉生活力。

图1 不同染色剂对黄花菜花粉生活力测定的结果

2.2 不同染色时间对黄花菜花粉生活力测定结果的影响

根据染色剂的筛选试验结果，对亚甲基蓝的染色时间作进一步研究试验，试验结果如图2 所示。染色时间为10～25 min 时，黄花菜花粉染色率随亚甲基蓝染色时间的延长而增加，花粉的平均染色率分别达到34.37%、37.70%、48.64%和52.47%；染色10 min 和15 min 处理，花粉染色率差异不显著，20 min 染色处理花粉平均染色率显著高于10 min 和15 min 染色处理，但较25 min 染色处理差异不显著；染色时间继续增加，达到30 min、35 min 时，染色率分别为49.81%和52.48%，较20 min 染色处理均无显著差异。由此可见，测定黄花菜花粉生活力的染色时间以20 min为佳。

图2 染色时间对黄花菜花粉染色率的影响

2.3 蔗糖浓度对黄花菜花粉萌发的影响

蔗糖浓度对黄花菜花粉萌发的影响见表1。

表1 各处理黄花菜花粉的萌发率

由表1 可知，黄花菜花粉萌发率随培养基中蔗糖浓度的增加呈先升高后降低趋势。培养基中不含蔗糖时，黄花菜花粉萌发率最低，仅为4.22%，且花粉管伸长不明显（见图3a）；当蔗糖浓度增至30 g/L 时，黄花菜花粉萌发率达到最大值，为59.18%，萌发花粉的花粉管长度也最长（见图3b）；蔗糖浓度继续增加至60 g/L时，黄花菜花粉萌发率略有下降，为52.33%，较30 g/L 处理差异不显著，花粉管长度也较长，仅次于30 g/L 处理（见图3c）；当蔗糖浓度升至90 g/L时，黄花菜花粉萌发率迅速降低，仅为14.31%，较30 g/L处理和60 g/L处理差异达极显著，花粉管长度下降（见图3 d）；当蔗糖浓度为120 g/L 和150 g/L 时，花粉萌发率继续下降，分别为6.28%和5.48%，较不加蔗糖处理差异不显著，但均显著低于90 g/L 处理，花粉管形态粗短（见图3e、图3f）。由此可见，黄花菜花粉离体萌发最适蔗糖浓度为30 g/L。

图3 不同蔗糖浓度对黄花菜花粉管生长的影响

3 结论与讨论

准确鉴定花粉活力是植物杂交育种的基础条件。通过对花粉进行染色制片，即可利用显微镜观察快速检测花粉活力。目前，用于检测花粉活力的染色方法有醋酸洋红染色法、TTC染色法、亚甲基蓝染色法和I2-KI 染色法等，但不同植物的鉴定方法常因物种差异而各不相同。研究表明，TTC 染色法是鉴定金娃娃萱草花粉生活力的最佳染色方法，染色时间为35～40 min时染色效果最佳[13]；I2-KI适用于四川牡丹花粉生活力的快速鉴定[14]；醋酸洋红染色法适用于油菜花粉生活力的测定[15]；次亚甲基蓝和α-萘酚-联苯胺适用于快速检测贴梗海棠花粉的生活力[16]。本研究采用3 种不同染色法对黄花菜花粉生活力进行了检测，发现用醋酸洋红和TTC 染液染色的花粉颜色差异极小，而在亚甲基蓝作用下，有生活力的花粉被染成了蓝色，与无生活力花粉颜色相比差异显著。因此，亚甲基蓝染色法可作为一种经济、便捷、安全的方法用于黄花菜花粉生活力的快速检测。除染色剂外，染色时间对染色效果也有一定的影响。染色时间太短，染色剂与花粉中的相关物质或酶反应不充分，染色率低；染色时间过长，又可能降低参与染色反应的酶活性，影响检测准确性，同时也不利于染色法的快速检测，影响检测效率。本试验在明确亚甲基蓝染色法为黄花菜花粉生活力检测最适宜方法的基础上，对亚甲基蓝的染色时间做了进一步研究，结果发现染色20 min 时黄花菜花粉平均染色率较高，之后随着染色时间的增加，平均染色率有所提高，但较染色20 min 差异并不显著。综上所述，利用亚甲基蓝染色20 min，即可对黄花菜花粉生活力实现快速测定。

选用染色法鉴定花粉生活力，虽然经济便捷，容易掌握，但因染色法是通过花粉中营养物质含量或代谢情况反映花粉生活力，衰老或死亡的花粉也可能会着色，且染色后有活性与无活性染色界线不易分辨，会造成测定值偏高，不能准确反映花粉的生活力[17～18]。离体萌发法虽然需要较长时间培养，但可实现对花粉生活力的完全定量检测[18]。蔗糖是花粉离体培养最重要的能量物质，其不仅能维持外界环境的渗透平衡[19]，还可在一定程度上减少微生物的污染（大部分微生物生长所需碳源为葡萄糖）。适宜浓度的蔗糖可在一定程度上缓解花粉破裂，促进花粉萌发和花粉管生长。蔗糖浓度过低易使花粉吸水涨破，导致花粉内容物流出，而浓度过高又会造成花粉脱水，导致其活性降低，对花粉萌发产生明显的抑制作用[20～21]。本试验结果印证了上述结论，较低或较高浓度的蔗糖均不利于黄花菜花粉萌发，黄花菜花粉离体萌发适宜的蔗糖浓度为30 g/L。

为提高检测的准确性，可将亚甲基蓝染色法与花粉离体萌发法结合起来，即先利用染色法判断黄花菜花粉生活力的基本情况，再通过离体萌发法实现花粉生活力的定量检测。在后续研究中，为进一步提高黄花菜花粉的萌发率，还需对培养过程中硼酸、温度等条件进行研究，同时应扩大选材范围，分析和掌握不同品种黄花菜花粉生活力的差异，为开展黄花菜杂交育种工作提供更好的方法。