脓毒症小鼠脾脏CD4+T 细胞miR-142-3p 的表达与其意义＊

陈海鸣 ，韦华璋 ，朱建光 ，熊启安 ，邓陶 ，温志超 ，王联群

（1.南昌大学第一附属医院急诊外科，南昌 330006；2.井冈山大学附属医院重症医学科，吉安 34300；3.安福县人民医院重症医学科，安福 34300；4.南昌大学第一临床医学院，南昌 330006；5.南昌大学第一附属医院重症医学科，南昌 330006）

全球每年脓毒症患者数超过 1900 万，其中有600 万患者死亡，病死率超过 1/4，给全球的医疗卫生带来了巨大的负担[1]。微小RNA（miRNA）是一种非编码RNA，在转录后水平调节基因表达。研究表明， 某些miRNA 参与了脓毒症的发生发展。miR-142 被认为是T 细胞特异性miRNA， 在调节T 细胞的发育中起着重要的作用。我们分离脓毒症小鼠脾脏CD4+T 细胞并检测miR-142-3p 的表达水平，观察其与相关炎症因子表达的相关性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验对象及分组 采用野生型清洁级雄性C57BL/6 小鼠 28 只，6-8 周龄，体重(22±2)g，适应性饲养3d，自由进食、饮水，昼夜节律12h，环境温度维持在26℃左右，湿度维持在40%-60%。 随机分为两组：假手术组、脓毒症组，每组各14 只。本研究通过了医院动物伦理委员会的审批。

1.2 实验方法

1.2.1 构建小鼠CLP 脓毒症模型 2%水合氯醛溶液（15ml/kg）腹腔注射，麻醉成功后小鼠仰卧位固定，消毒，沿腹部正中线切开皮肤及腹膜，暴露盲肠，于盲肠根部至末端1/2 处使用3-0 号丝线结扎盲肠， 用22G 穿刺针从系膜缘向对系膜缘贯穿言肠一次并挤出少量肠内容物；还纳盲肠，逐层缝合腹膜及皮肤， 术毕立即颈后皮下注射0.9%生理盐水1ml 补液。 术后自由进食饮水，保持室温及湿度恒定。 假手术组小鼠在麻醉后仅开腹暴露盲肠后还纳，随后缝合腹膜及皮肤，颈后皮下补液。

1.2.2 免疫磁珠分选小鼠脾脏CD4+T 细胞 所有小鼠均于建模手术后48h 断颈处死， 剪开腹部皮肤，留取脾脏，剪碎，取出脾脏，置于400 目滤网，研磨，收集细胞悬液，重悬后按1：1 滴淋巴细胞分离液 （ Ficoll-Hypaque 1.080， 天津川叶公司），离心， 小心吸取中间云雾层细胞获取脾脏单个核细胞，通过MiniMACs 免疫磁性分离系统得到纯化的CD4+T 细胞，吹打混匀，置于-80℃冰箱保存备用进行PCR 检测。

1.2.3 荧光实时定量（RT）-PCR 按miRneasy Mini试剂盒（德国QIAGEN 公司）说明书步骤，CD4+T细胞添加QIAZOL 溶液提取总RNA， 紫外分光光度计测定260nm（A260）的吸收值计算RNA 浓度，保证在 0.15-1.0。 按 miscript II RT Kit 说明，经逆转录合成cDNA，测定引物由QIAGEN 公司设计合成，以 Hs-RNU6-2（MS00033740）为内参。 普通mRNA 按试剂盒（美国Thermo 公司）说明，反转录合成cDNA，再进行PCR 扩增35-50 个循环，取扩增产物 10μl，2%琼脂糖凝胶中，90V 电泳 30min，回收纯化，并送交上海Invitrogen 公司测序，测序结果与GeneBank 中目的基因mRNA 序列完全一致。 根据Gene Bank 中基因mRNA 序列设计目的引物（由北京天根公司合成），以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。 miR-142-3p 测定采用SYBR Green Kit（德国 QIAGEN 公司），每个反应体系均为15μl，使用罗氏Light Cycler480Ⅱ荧光定量PCR 仪检测其表达，每个反应设3 个复孔，采用内参进行归一化。具体操作参照说明书。待测因子表达应用 Relative Quantification Soft ware Ver1.0 软件进行数据分析， 结果以目的基因/GAPDH 或U6比值表示。

1.2.4 酶联免疫吸附法检测外周血细胞因子 收集小鼠眼球血液样本，分离血清，采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-2 表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件进行数据分析。 单因素分析中，采用卡方检验对计数资料进行分析，采用t 检验对计量资料进行分析，正态计量资料用（）表示，检验水准 a=0.05，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠盲肠结扎穿孔术脓毒症模型构建 建模后小鼠表现为：嗜睡，活动、摄食减少，目光呆滞，呼吸急促、严重者发绀，7d 生存率40%，中度脓毒症模型构建成功。

2.2 两组miR-142-3p 及炎症因子的表达水平比较 脓毒症组miR-142-3p 较假手术组升高 （P<0.05）， 脓毒症组 IL-6 和 TNF-α 的表达水平较假手术组明显升高，差异有非常显著意义（P<0.01）；IL-1β 和 IL-2 的表达水平亦较假手术组升高 （P<0.05），见表 1。

表1 miR-142-3p及相关炎症因子的表达水平（）

表1 miR-142-3p及相关炎症因子的表达水平（）

与假手术组比较，*P<0.05；**P<0.01

0.014 0.000 0.029 0.000 0.036指标 脓毒症组（n=14） 假手术组（n=14） t P miR-142-3p TNF-α IL-1β IL-6 IL-2 38.81±13.6*52.8±22.6**48.6±18.8*62.2±11.3**39.6±9.8 28.47±7.11 39.4±9.8 38.2±11.2 14.9±6.3 32.8±10.6 2.565 6.486 2.954 10.128 2.367

3 讨论

虽然在过去数十年中， 脓毒症的发病机制研究在病原微生物、细胞免疫学、病理生理学、基因/蛋白质组学等领域取得了一定进展， 然而脓毒症免疫紊乱的致病机制仍未阐明[2-4]，其中CD4+T 细胞是细胞和体液免疫反应的重要参与者， 其功能性分化是脓毒症免疫功能紊乱的关键环节。

脓毒症早期释放的细胞因子转化为促炎和抗炎细胞因子2 大类，促炎细胞因子主要包括TNF-α，IL-1，IL-6，IFN-γ 等， 其中 TNF-α 是炎症早期最主要的促炎细胞因子， 也是内毒素损伤效应的关键介质，IL-1 通过 IL-1β 表达并与 TNF-α 共同启动炎症反应。 IL-6 是在IL-1 作用下产生的炎症介质，可作为脓毒症严重程度的预测指标[5,6]。 上述促炎细胞因子的释放与脓毒症炎症的发生发展紧密相关。

微小 RNA（microRNA，miR）是一类长度约为22 个核苷酸的内源性非编码单链RNA。 越来越多的研究证实， 某些特定的miR 已经被报道参与了脓毒症的免疫调控，并在诊断、治疗以及预后中发挥着重要的精细调节作用[7,8]。miR-142 首先发现在老鼠的脾脏、胸腺表达，并T 细胞中表达特别高，对调节T 细胞的发育起着重要作用。Moschos[9]发现小鼠肺脂多糖处理后，miR-142-3p 的表达上调，地塞米松预处理可抑制miR-142 的上调， 研究表明miR-142 可能与炎症反应相关， 参与了免疫应答。Sun[10]检测了8-12 周龄的小鼠树突状细胞体外LPS 刺激后分泌的细胞因子TNF-α、IL-10 和IL-12， 随后进行转基因组小鼠miR-142-3p 的过表达，TNF-α、IL-10 和 IL-12 的表达明显增加，并减少了内毒素引起的死亡率。

本研究采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症小鼠模型[11]，稳定的死亡率是衡量脓毒症小鼠稳定性的一个标准， 影响死亡率的主要因素是结扎长度和贯穿次数，穿孔直径，一般结扎长度按照占盲肠总长度比例计算， 分为1/3、1/2 和全部盲肠结扎，根据以上比例分为轻度、 中度和重度脓毒症模型，1周内死亡率也分别约为30%、60%和90%。 本研究建模后小鼠表现为嗜睡，活动、摄食减少，目光呆滞，呼吸急促，严重者发绀，7d 生存率40%，表明中度脓毒症模型构建成功。 建模后48h 脓毒症小鼠促炎细胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β 和 IL-2 大量释放，表达水平升高，尤其是TNF-α 和IL-6 升高显著， 免疫磁珠分选获得CD4+T 细胞miR-142-3p表达水平较假手术组水平升高， 与炎症因子水平上调一致，与文献报导一致，提示测定脓毒症患者CD4+T 细胞miR-142-3p 的表达也可以作为判断患者的感染炎症指标之一， 有助于脓毒症的诊断和治疗， 为脓毒症的进一步基因靶向治疗提供了新的研究方向。