不同波长变化HPLC法同时测定护肝片中主要成分含量分析

李 岩，李本淳，张成颖，王 彤

（1.白城市食品药品检验所，吉林 白城 137000；2.四平市食品药品检验所，吉林 四平 136000； 3.大连市妇女儿童医疗中心，辽宁 大连 116037；4.吉林省白城市实验高级中学，吉林 白城 137000）

在慢性肝炎、早期肝硬化治疗对策中，护肝片因所具健脾消食、疏肝解郁功用以及降低转氨酶功效而为主选中药方制剂[1]。护肝片组方为板蓝根313 g、柴胡313 g、猪胆粉20 g、茵陈313 g、五味子168 g、绿豆168 g，但目前《中国药典》2015年版仅限五味子醇甲含量测定，对复方质量难以做出全面客观评价[2]。文献报道在护肝片质控方面，护肝片高效液相色谱分析法（HPLC）建立及多成分含量测定为之提供了新的思路[3]。本文采用双波长HPLC法开展护肝片主要成分定量研究，为进一步提高护肝片的质量标准，保证质量可控。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪、HH-2型恒温水浴锅、CPA 225D精密电子分析天平、HS2060超声波清洗器、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵。

护肝片：属糖衣片制剂，片心净重0.35 g；对照品：统一自中国食品药品检定研究院购进，依次取纯度为94.9%、96.8%、99.9%、99.5%、99.0%的牡荆苷（批号111687-201704）、绿原酸（批号110753-201817）、五味子醇甲（批号110857-201714）、五味子甲素（批号110764-201714）以及五味子乙素（批号110765-201512）；购Fisher公司乙腈为色谱纯，取磷酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液

依次对上述对照品精准称取，加甲醇溶解，制成每 ml含牡荆苷、绿原酸、五味子醇甲、五味子甲素以及五味子乙素各0.04、0.04、0.13、0.038、0.04 mg混合溶液，于冰箱内冷藏备用。

2.1.2 供试品溶液

对护肝片予以适量称取，研磨成细粉状，对其进行精密称定0.35 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 ml，称定重量，超声处理（功率60 W，频率40 kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

研究所用为ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm， 5 μm），甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱（20～30 min为45%～85%A，11～20 min为35%～45%A，10～11 min为5%～35%A，0～10 min，5%A）；流速 1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长取两种，即0～20 min 340 nm和20.01～40 min 254 nm，进样量20 μL。

2.3 线性关系考察

精密量取对照品溶液，加50%甲醇，经1倍、2倍、 4倍、8倍、16倍稀释，自所得系列浓度溶液中各取20 μL进样，展开峰面积测定。结果显示各自浓度范围内5种成分线性关系良好，γ≥0.9999。

2.4 精密度试验

按照上述色谱条件对精密量取供试品溶液连续进样 6次，测定五种成分峰面积RSD均＜3%，证实仪器精密度 良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液放置于室温下，0、6、12、18、24 h进样分析，所测定各成分峰面积RSD＜3%，表明供试品待测成分在24 h内可保持良好稳定性。

2.6 重复性试验

以同样方法平行备份同一批次供试品溶液，按照上述色谱条件分析，护肝片各成分峰面积RSD＜3%，证实方法重复性良好。

2.7 样品含量测定结果

按照供试品溶液制备方法对研究所取不同批号护肝片进行制备，并经上述色谱条件开展进样测定，对5种成分含量予以外标法计算，结果见表1。

表1 护肝片中5种含量测定结果（mg/片，n=3）

3 讨 论

对于提取溶剂的选择，主要考虑到绿原酸、五味子醇甲等均于甲醇溶解，在对不同浓度的甲醇溶液（50%、75%、100%）实施试验后，证实50%甲醇提取情况下，各成分所获峰形均表现良好，且绿原酸峰形为最高。而在对溶剂用量、超声时间对结果的影响考察中，发现20 mL、 30 min为最佳值。

甲醇作为流动相于试验中获得良好峰形，并对0.05%、0.1%、0.3%及0.2%磷酸浓度予以比较，结果0.05%时峰形最差，0.2%峰形最好。此外，在pH≥1偏酸性环境下，ZORBAX SB-C18柱有较好耐受性，试验用0.2%磷酸水溶液pH值在1.95左右，因此该色谱柱完全可满足要求。在对柱温的选择过程中，考察了25、30及35℃色谱图，色谱峰保留时间伴随温度上升而呈缩短显示，30℃时峰形良好，故确定此温度。对混合对照品应用PDA检测器进行190～400 nm波长扫描，显示在0～20 min检测波长为340 nm、20.01～40 min 254 nm为最佳。

4 小 结

护肝片对肝细胞保护及转氨酶降低具显著作用，机制为通过对受损肝细胞SOD、GSH活性的增强，使MDA产生受到抑制，进而保护细胞器与酶结构功能，提高肝细胞抗氧化能力[4-5]。但药效物质基础尚不确定且机制不清楚，对质量的控制标准较为单一，故对临床疗效的提高存在一定局限。为健全护肝片质量控制标准，本文对其主要成分含量予以不同波长HPLC法测定，结果显示不同批次护肝片中所含五味子醇甲经测定均在0.28 mg以上，符合《中国药典》所规定，但不同批次间各成分含量有一定程度不同，提示不同批号所选用中药原材料质量或有差异。经系统且全面的数据评价、分析及处理方法，可为后续护肝片的质控提供可行性参考与理论依据，且方法简便、准确，同时有利于生产厂家更为高效和合理的对药品质量把控。