不同盐度循环养殖水体微生物群落特征

冯国禄，罗金飞,*，廖永岩，李书迪

1.北部湾大学资源与环境学院，广西 钦州 535011 2.桂林理工大学环境科学与工程学院，广西 桂林 541006 3.北部湾大学海洋学院，广西 钦州 535011 4.广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室，广西 钦州 535011

海洋养殖业的发展受到环境污染的严重制约[1]，急需向绿色环保方向转型升级[2]. 工厂化循环水养殖(RAS)因节水节能等优势，是未来重要的养殖模式之一[3]. 工厂化养殖可有效避免青蟹间相互残杀，提高养殖成活率，但由于养殖系统相对封闭性，具有毒副作用的氮磷等污染物质排入其中，如不能及时被转化成为毒性更小，或无毒无害的物质，则会造成养殖动物因其毒害作用而死亡. 如何迅速转化水中具有毒副作用的氮磷物质是水产工业化养殖面临的关键问题[4]. 生物处理法作为一种无毒无害且不会造成二次污染的水质净化法[5]，被认为是处理养殖系统中溶解态污染物最经济有效的方式，它主要利用微生物的吸收代谢等作用，降解转化水体中的污染物[6].

盐度作为一种基本的海产品养殖要素，不仅可以显著影响青蟹的生理代谢，也会干扰水体微生物的新陈代谢，进而影响水中氮磷污染物的转化降解[7-8]. Rysgaard等[9]发现盐度与河口沉积物中的硝化作用速率成反比，当盐度从0‰升至10‰时，硝化作用速率下降了50%. Jackson等[10]研究发现，盐度可以有效增加沉积物中的微生物多样性，而高氮则会降低其多样性. 张磊等[11]研究内陆湖泊中微生物群落对营养盐和盐度双重胁迫的响应机制，发现α-变形菌纲的相对丰度随盐度的升高而增加，但会受到水体氮磷营养盐水平的制约. 探究不同低盐度下，氮磷环境因子与微生物群落结构的相关关系，对于保障养殖水环境健康具有重要的现实意义. 目前关于盐度对青蟹养殖影响的研究，更多地集中于对其生长状态的宏观性研究，如Stickle等[12]研究了盐度对2种青蟹存活状态的影响. 关于盐度对青蟹养殖水体微生物群落的影响还鲜见报道，而工厂化养殖系统由于其相对封闭性和高稳定性[13-14]，为探究环境因子与养殖水体微生物群落的相关关系提供了独一无二的优质试验场所.

该研究在五组盐度梯度(1‰、3‰、5‰、7‰、9‰)下开展拟穴青蟹循环水养殖试验，分析比较了不同盐度下青蟹养殖水体的微生物群落特征，探讨了循环养殖水体中盐度、氮磷营养盐因子与微生物群落三者之间的相关关系，以期为海水养殖水体中的污染物控制提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验设计

在广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室的循环水养殖系统中开展为期21 d的拟穴青蟹养殖试验，各组所用青蟹数量、规格质量(55±4.05)g和批次均相同，饲料投喂量相同. 每组循环水养殖系统水量为3 m3，循环水流量为3 m3/h. 养殖盐度分别为1‰、3‰、5‰、7‰、9‰，对应命名为S1、S3、S5、S7、S9，以青蟹极限生存盐度5‰[15-16]的盐度组为对照组. 养殖用水取自同一批天然海水，水质呈天然弱碱性，经过滤稀释后投入养殖系统中. 通过添加NaHCO3调节pH至7.8±0.3，通过制氧机(CC-O2-15A，广州畅驰环保科技股份有限公司)维持系统ρ(DO)为7 mg/L，通过恒温机(CC-SC-3ANJ6B，广州畅驰环保科技股份有限公司)维持水温为26 ℃.

1.2 水样采集及数据分析

所采水样保存于1 L无菌玻璃瓶中，采集完成后低温保存带回实验室测定分析. 水质检测指标分别为水温、pH、ρ(DO)、ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)、ρ(PO43--P)和ρ(TP). 水温、ρ(DO)采用YSI溶氧仪(YSI6920，美国维赛仪器公司)现场测定，pH采用哈纳pH计(HI98312，意大利哈纳沃德公司)测定.ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)、ρ(PO43--P)和ρ(TP)均采用德国SEAL流动注射分析仪(AA3，德国Seal公司)检测[17-19]，测定3个平行样，结果取其平均值. 青蟹质量使用电子天平(CAV114C，美国奥豪斯公司)测量，结果取其平均值.

1.3 高通量测序及分析

取500 mL水样经0.22 μm微孔滤膜过滤，采用CTAB法提取样本DNA，通过凝胶电泳检测所提样本DNA纯度和浓度，之后取适量样本DNA稀释至1 ng/μL. 以稀释后的基因组DNA为模板，根据选择的测序区域，使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR扩增，同时采用回收试剂盒回收产物；采用单端测序(Single-End)法构建小片段文库进行单端测序；采用Qiime软件计算Alpha多样性指数，并绘制稀释曲线.采用维恩图和UPGMA聚类树分析样品细菌群落之间的相似性；通过微生物相对丰度柱形图比较样品的细菌群落结构；采用Mantel test分析和典范对应分析得到循环水体中微生物群落和氮磷环境因子之间的相关关系.

2 结果与讨论

2.1 养殖水体理化性质

不同盐度的养殖系统水质参数如表1所示. S1和S3的养殖水体中ρ(TP)相对较高，其次为S7.ρ(TN)在S1最高，其次为S3，这与盐度对拟穴青蟹的胁迫有关. 盐度作为一种调节渗透压的离子，可以显著影响甲壳动物生长存活[20]，当养殖盐度低于最低极限生存盐度时，为了维持渗透压，养殖动物会增加排泄量，加剧养殖水体污染[21]，因此S1和S3水中氮磷污染物浓度较高. 对青蟹的生长情况进行分析，发现在S1、S3的青蟹生长速率显著低于S5、S7、S9(P<0.05)，S5、S7、S9的青蟹生长速率无显著性差异(P>0.05). S9的青蟹生长速率最快，其正常生理代谢最旺盛，导致其水中ρ(NH4+-N)最高. 该研究发现，养殖水体中污染物浓度与盐度之间无明显相关关系，这可能与盐度造成养殖水体微生物群落的差异化有关，不同微生物对污染物的转化效率不同.

表1 不同盐度水体水质参数

2.2 微生物群落多样性分析

以97%的一致性对所有有效OTU序列进行聚类分析，得到细菌在不同分类水平上的数目分别为67门74纲152目281科745属431种，说明在养殖水体中具有较高的微生物多样性. 所有水样的有效序列数统一抽取至 46 378 条，S5的OTU数目最少，为443 bp，S3水样中具有最多的OTU数目，为912 bp，S1的OTU数目为861 bp，S7和S9的OTU分别为646和546 bp. 绘制基于OTU的稀释曲线(见图1)，发现稀释曲线均随序列数的增加而逐渐趋于平缓，说明测序数据量渐进合理，测序结果能反映养殖水体中细菌多样性的真实情况.

图1 高通量测序稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of high-throughput sequencing results

高通量测序的多样性指数如表2所示，Coverage指数表明测序深度均在99.9%及以上，说明水样中微生物基因未被检出的概率极低. PD_whole_tree指数显示，S1和S3样品中优势菌种的地位和作用显著高于S5、S7和S9. Chao1指数和Ace指数都是衡量样品中的物种数目，五组样品中物种数目从大到小依次为S3、S1、S9、S5、S7，Chao1指数和Ace指数都印证了该结果的准确性，二者之间也相互验证. 在Alpha Diversity指数中，Shannon-Wiener指数是用来衡量样本丰富度和均匀度，S3的Shannon-Wiener指数最高，S1其次，S5最低. Simpson指数反映样本的物种群落多样性，所有样本中S1和S3的微生物群落多样性相对较高，S5的最低. 在五组水样中，S1和S3的水体中，微生物的物种数目和丰富度较高，这可能是由于水中氮磷浓度较高造成的. 大量研究表明，水中氮磷浓度会明显影响微生物群落多样性，如陈兆进等[22]研究发现，NH4+-N等环境因子会对丹江口水库中微生物多样性指数造成影响；李玉华等[23]发现水深会造成TN、TP含量发生变化，间接导致松花湖水体中微生物群落多样性发生变化. 在养殖水体中盐度变化会改变细菌的群落特征，但其是直接作用还是间接作用，或者共同作用，目前尚不明确，其关键驱动因子也有待探究.

2.3 微生物群落相似性分析

表2 养殖水体细菌多样性指数

为了更加直观地表现盐度对养殖水体微生物群落的影响，采用维恩图对其OTU数目相似性及重叠情况进行展示，结果见图2. 由图2可见，S1、S3、S5、S7和S9特有的OTU数目分别为321、456、82、155和96，五组水样的总OTU数为1 943，共有OTU数为111，占总OTU数的5.71%，说明五组水样的相似度较低，盐度的波动会明显改变养殖水体微生物群落，同时也说明微生物对外界环境变化具有非常灵敏的响应机制.

图2 OTU分布维恩图Fig.2 Venn diagram showing the distribution of OTU

图3 微生物群落的聚类树与条形图Fig.3 Cluster tree of microbial community

对养殖水体微生物群落进行UPGMA聚类分析，结果见图3. 由图3可见，S1和S3的微生物群落结构相似度高，S7与S9的相似度高，盐度为5‰的S5处于过渡阶段，因此S5与S1、S3、S7、S9均具有一定相似度，说明青蟹的极限生存盐度为5‰，可能与养殖水体中的微生物有直接关系，同时也说明养殖水体中微生物的群落结构与盐度梯度存在一定相关性. 王子超[24]研究发现，在SBR系统中盐度低于3%时，微生物多样性指数随盐度增加而增加. 王新莹[25]发现，在巴丹吉林天然盐碱湖泊中的古菌群落多样性随盐度的增加而降低，低盐度湖泊的种群多样性比高盐度的高. 罗勇等[26]发现，盐度可以显著影响燃料电池体系中的微生物群落.

2.4 微生物群落组成分析

为进一步判断盐度、氮磷营养盐、脱氮除磷微生物三者之间的相关关系，了解盐度对养殖水体微生物的影响，分别从门水平和属水平分析样品中细菌群落组成及分布. 养殖水样中门分类水平前10位的微生物群落相对丰度如图4所示，分别为变形菌门(Proteobacteria，占比为50.39%～72.47%)、厚壁菌门(Firmicutes，占比为2.98%～8.48%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，占比为15.95%～21.51%)、浮霉菌门(Planctomycetes，占比为1.16%～3.17%)、放线菌门(Actinobacteria，占比为0.34%～0.87%)、梭杆菌门(Fusobacteria，占比为0.01%～0.84%)、酸杆菌门(Acidobacteria，占比为0.01%～1.95%)、绿弯菌门(Chloroflexi，占比为0.33%～1.51%)、纤细菌门(Gracilibacteria，占比为0.16%～0.74%)以及少量分类地位不明确的细菌类群，并以变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主要微生物菌门. 五组水样中变形菌门相对丰度依次为S5>S7>S9>S1>S3，厚壁菌门相对丰度依次为S9>S3>S5>S7>S1，拟杆菌门相对丰度依次为S1>S7>S3>S9>S5.

由图4可见，五组水样中变形菌门均为绝对优势菌门，这与吴越等[27-28]的研究结果一致，即与养殖用水为海水有关，且有研究[29]表明变形菌门是海洋中主要的微生物菌群. 变形菌门主要由α纲、β纲和γ纲组成，其适应力强，同时参与水体自净，广泛分布于江河湖海中[30]. 微生物动态变化是对环境变化的有效响应，养殖水体氮磷等污染物含量高，而变形菌门是脱氮除磷降低水中COD的主要功能菌门，能够去除和转化多种污染物[31-33]. 这些氮磷污染物为变形菌门提供了丰富的营养物质，进一步促进了海水中变形菌门的生长繁殖，因此变形菌门占据了水体中绝对的生态位优势. 拟杆菌门均为第二优势菌群，拟杆菌门能有效地促进水中有机物的氧化分解，是维持生态系统碳循环的重要微生物菌群[34]. Cottrell等[35]研究发现，拟杆菌门对海洋中有机物的降解必不可少，尤其对蛋白质的降解转化效率高. 养殖动物会排泄出大量氮磷化合物，其中含氮化合物主要包括氨、尿素及蛋白质，同时残饵里也含有大量蛋白质，这些污染物促进拟杆菌门微生物在水中大量繁殖. 放线菌门微生物能分泌多种酶，促进水中蛋白质分解[36]. 厚壁菌门微生物能分泌多种消化酶和抗生素，也可以通过直接利用水中硝酸盐和亚硝酸盐从而净化水质[37]. 浮霉菌门微生物中的厌氧氨氧化菌可以将氨氮转化为氮气，降低水中氨氮含量，维护养殖水质健康[38]. 部分绿弯菌门微生物能够进行光合作用，配合部分拟杆菌门微生物降解水中有机物[39]. 酸杆菌门是由于在酸性环境中被发现而得名[40]，但是也有部分研究[41]显示该菌也可以存在于碱性环境下，试验所用海水为天然弱碱性海水，发现存在酸杆菌门，但相对丰度极低.

由于循环水养殖系统的相对封闭性，水中氮磷等污染物主要依赖于脱氮除磷微生物的转化，分析不同盐度水体中脱氮除磷微生物的分布特征，对了解盐度对养殖水体微生物群落的影响具有代表性作用. 相对丰度前40位的属水平细菌中，具有脱氮除磷特性的有14种(见表3)，主要为具有反硝化作用的福格斯氏菌属(Vogesella)、不动杆菌属(Acinetobacter)和气单胞菌属(Aeromonas)，其可将养殖水体中的NO3--N在无氧的条件下还原为(NO2--N、NO、N2O)，最后还原为氮气. 养殖水体在充氧装置的作用下始终处于好氧状态，反硝化作用被抑制，水中含氮污染物难以通过反硝化作用得到去除. 养殖水体中含有大量的好氧反硝化细菌，NO3--N在好氧反硝化作用下以氮气的形式被脱除，可有效降低水中的无机氮含量. 在不同盐度的养殖水体中，好氧反硝化所依赖的微生物种类不同. S1中主要依赖于黄杆菌属(Flavobacterium)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)；S3中主要依赖于鞘脂单胞菌属；S5和S7中主要依赖于黄杆菌属和弧菌属(Vibrio)等；S9中主要依赖于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、黄杆菌属和副球菌属(Paracoccus)等. 养殖水体磷酸盐的去除转化主要依赖于不动杆菌属和希瓦氏菌属(Shewanella)，其相对丰度在S5、S7、S9中明显高于S1、S3的养殖水体，因此在S5、S7、S9水体中ρ(TP)也较低. 在S1的养殖水体，好氧固氮微生物固氮螺菌属(Azospira)和吸收有机氮的球衣细菌(Sphaerotilus)相对丰度显著高于其余盐度组，因此S1中ρ(TN)最高. 综上，不同盐度的养殖水体中主要的脱氮除磷微生物种类不同，其相对丰度也不同，盐度的变化会极大地影响养殖水体微生物群落组成，水中氮磷污染物也会导致其发生变化，但直接驱动因子和关键驱动因子尚不明确.

2.5 微生物群落与环境因子相关性分析

为更全面地探究盐度对养殖水体微生物群落的作用机制，分析盐度、氮磷环境因子、微生物群落三者的相关性意义重大. 首先采用典范对应分析对造成水样差异化的氮磷环境因子进行筛选，然后采用Mantel test相关性分析进一步得到造成微生物群落结构差异化的主要环境驱动因子. 典范对应分析(CCA)结果中轴1(CCA1)和轴2(CCA2)对样本中属水平微生物群落分布的解释度分别为19.84%和46.96%(见图5)，两个轴的总解释度为66.8%，这说明氮磷是直接影响养殖水体微生物群落结构的主要环境因子.ρ(NO2--N)、ρ(PO43--P)和ρ(TN)为轴1上的主要影响因子，ρ(NH4+-N)和ρ(TP)为轴2上的主要影响因子. S1与ρ(NO3--N)、ρ(TN)、ρ(TP)均呈正相关，S3与ρ(NO2--N)、ρ(PO43--P)均呈正相关，S5、S9与ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)、ρ(TP)均呈负相关，S7与ρ(NH4+-N)、ρ(NO3--N)、ρ(PO43--P)均呈负相关，这说明盐度是直接导致水体中氮磷环境因子出现差异化的主要原因. 在生态系统承载范围内，系统中的污染物与微生物息息相关，二者既相互促进，也相互制约，直至达到动态平衡. 具有反硝化作用的福格斯氏菌属与ρ(NO3--N)均呈显著正相关(P<0.05)，这可能是由于ρ(NO3--N)较高，促进了福格斯氏菌属的繁殖；Marivivens、假交替单胞菌属、黄杆菌属与ρ(NO3--N)、ρ(PO43--P)均呈显著负相关(P<0.05)，这主要与该类菌属具有好氧反硝化特性以及反硝化过程的电子传递有关；具有好氧反硝化特性的弧菌属(Vibrio)与ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)均呈负相关；ρ(TP)与粘着杆菌(Tenacibaculum)呈极显著负相关(P<0.01)，与红球菌属(Rhodococcus)、叶杆菌属(Phyllobacterium) 均呈正相关；乳球菌属(Lactococcus)与ρ(TN)呈显著负相关(P<0.05)，这可能与乳球菌属的益生菌特性有关[56]，乳球菌属还具有提高水产品质量以及抑制病原菌的作用[57]. 综上，盐度主要是通过影响拟穴青蟹生理代谢导致水体中氮磷环境因子出现差异，间接影响养殖水体微生物群落结构.

表3 养殖水样脱氮除磷功能菌分布特征

图5 水体环境因子的CCA分析Fig.5 CCA analysis of physical and chemical factors

营养盐因子的种类和浓度会造成水中微生物群落差异化. 为了进一步明确营养盐中的关键驱动因子，采用Mantel test分析对相关的氮磷环境因子进行筛选，结果如表4所示. 对单一营养盐分子而言，对门水平微生物群落的影响从大到小依次为ρ(NO2--N)、ρ(TN)、ρ(TP)、ρ(NH4+-N)、ρ(PO43--P)、ρ(NO3--N)，其中NO2--N对微生物群落具有显著性影响(P<0.05)，单一营养盐与属水平微生物群落的相关性依次为ρ(NO2--N)>ρ(PO43--P)>ρ(TP)>ρ(TN)>ρ(NH4+-N)>ρ(NO3--N)，ρ(NO2--N)与微生物群落结构呈显著正相关(P<0.05). 系统中的能量流动生生不息，在这个过程当中往往伴随着物质的循环转化，各个物质处于不断的形态转化之中，如水中三氮污染物会在微生物的作用下不断相互转化，因此整体分析氮化物和磷化物对微生物的影响，对加深了解关键驱动因子具有十分重要的作用. 该研究发现，ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)的复合营养盐因子与属水平微生物群落呈显著正相关(P<0.05)；ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(PO43--P)的复合营养盐因子与属水平微生物群落呈极显著正相关(P<0.01)，与门水平微生物群落的相关系数为0.564；ρ(TP)和ρ(TN)不会对微生物群落产生太大影响. 综上，ρ(NO2--N)是影响养殖水体中微生物群落的主要营养盐因子，系统中的营养盐因子并不是单独地对微生物群落起着作用，而是协同发挥，共同调节，营养盐元素在相互在转化过程中，对微生物群落的影响程度尽管可能会被削弱，但仍不可忽略，营养盐因子之间的相互作用机制和对微生物群落的影响方式还需进一步深入研究.

表4 环境因子与门水平微生物群落Mantel test分析

3 结论

a) 在五组盐度的拟穴青蟹循环养殖水体中，细菌群落共有67门74纲152目281科745属431种，Ace指数和Chao 1指数显示物种丰度依次表现为S3>S1>S5>S7>S9，Shannon-Wiener指数表明细菌的多样性依次表现为S3>S1>S9>S7>S5，Simpson指数表明细菌的丰富度和均匀度依次表现为S1>S3>S7> S5>S9.

b) 五组盐度的养殖水体中共有OTU数占总OTU数的5.71%，S1与S3养殖水体微生物群落结构相似度高，S7与S9养殖水体中微生物群落结构相似度高.

c) 五组盐度的养殖水体中，变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主要微生物菌群，养殖水体优势菌种中大量为具有脱氮除磷特性的微生物.

d) 4种营养盐中的ρ(NO2--N)对养殖水体微生物群落结构具有显著影响(P<0.05)，ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)和ρ(PO43--P)整体与属水平微生物群落呈极显著正相关(P<0.01)，养殖水体中营养盐因子协同对微生物群落发挥作用，但其营养盐元素之间的相互作用机理还有待进一步研究.