婴幼儿腹泻人群中鼠伤寒沙门菌的流行病学及多重耐药特征研究

王路梅，郭 惠，童 晶，吴畏畏，刘庭君，郑东宇

鼠伤寒沙门菌是沙门菌属中引起小儿肠道感染最常见的致病血清型[1-2]，属于沙门菌群B群。人群对鼠伤寒沙门菌普遍易感，婴幼儿多为显性感染，以胃肠型为主[3]，相关研究中多是以儿童为研究对象，婴幼儿(0～3岁)感染资料尚不足。婴幼儿免疫功能尚未完善，抵抗力较弱，抗菌药物是治疗儿童鼠伤寒沙门菌肠炎的重要手段，多重耐药鼠伤寒沙门菌已在世界各地陆续报道[4-5]，耐头孢菌素鼠伤寒沙门氏菌的出现及数量的增加已经引起全世界的关注，成为临床治疗的难点。为了掌握鼠伤寒沙门菌在婴幼儿腹泻人群中的流行情况，了解其多重耐药特征，防止多重耐药菌在弱势人群中的传播，遏制不合理抗生素应用，本研究对2014—2018年徐州地区婴幼儿腹泻人群进行了鼠伤寒沙门菌监测，并对其耐药特征和多耐药菌株之间的分子流行病学关系进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 标本来源 依托全国食源性疾病监测系统，收集2014－2018年徐州市医院1 343份婴幼儿(0～3岁)腹泻病患者粪便标本，病例以腹泻症状为主诉，近1周内未使用过抗生素，每日排便大于3次及3次以上，且粪便性状异常。

1.1.2 质控菌株 血清分型质控菌株为鼠伤寒沙门氏菌ATCC140128，药敏试验质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922，上述菌株购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)，脉冲场凝胶电泳分子量标准菌株为沙门氏菌H9812，由江苏省疾病预防控制中心食安所提供。

1.1.3 主要仪器和试剂 VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定及药敏分析系统(法国梅里埃公司);PCR扩增仪、脉冲场凝胶电泳系统、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司);SBG增菌液(广州环凯微生物试剂有限公司);科玛嘉沙门显色培养基(上海科玛嘉微生物技术有限公司);沙门氏菌属诊断血清(宁波天润生物制品研究所及丹麦S&A);Vitek GN鉴定卡、GN 13、GN 14药敏测试卡(法国梅里埃公司);药敏测试用纸片:头孢他啶30μg、头孢他啶/克拉维酸30/10μg和头孢噻肟30μg、头孢噻肟/克拉维酸30/10μg，(英国OXID公司);限制性内切酶Xba I、Bl n I购自宝生物工程(大连)有限公司;脉冲场电泳用琼脂糖为Sea Kem○RGold Agarose低熔点琼脂(美国Ca mbrex公司);蛋白酶K为德国Merck公司产品。质粒小提取试剂盒(DP106)为天根生化科技公司产品。

1.2 方 法

1.2.1 分离鉴定 按照《GB 4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门菌检验》、2014－2018《全国食源性疾病监测工作手册》进行沙门菌的分离、鉴定病原学表型检测。

1.2.2 沙门菌血清分型 按照考夫曼抗原表[6]，将鼠伤寒沙门氏菌分为双相的鼠伤寒沙门菌血清型(1，4，12:i:1，2)和单相变体的鼠伤寒沙门菌变种血清型(1，4，12:i:—)。

1.2.3 耐药模型检测 采用VITEK 2 Co mpact GN13和GN14药敏系统的最低抑菌浓度法(MIC)测定72株菌对10类抗生素18种代表药物的敏感性。参照CLSI M100-S26[7]《美国临床和实验室标准协会抗菌药物敏感性试验标准》进行抗生素分类和判断结果。按照临床实际用药规范[8]，排除对沙门菌无效的一代头孢，根据多重耐药定义[9]，对上述3类或3类以上抗菌药物不敏感定义为MDR(multidrug resistant)，对上述6类或6类以上抗菌药物不敏感定义为XDR(extensive drug resistant)。

1.2.4 产ESBLs表型检测 按照CLSI M100-S26[7]中的双纸片协同法来确定鼠伤寒沙门菌的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药表型，并且严格进行质量控制。

1.2.5 产ESBLs耐药基因CTX-M检测及产物确定 对产ESBLs表型菌株检测常见耐药基因CTXM及其亚型，按照细菌质粒提取参考小提试剂盒说明书的碱裂解法对细菌质粒DNA进行提取，对6种特异耐药基因[5]进行PCR扩增，PCR反应条件为:95℃预变性5 min;94℃变性15 s，退火15 s，72℃延伸30 s，反应共30个循环;72℃延伸5 min。PCR阳性扩增片段送上海生物工程公司测序验证，使用BLAST在Gen Bank上查询比较，确定基因亚型。

1.2.6 PFGE分型及数据分析 PFGE操作实验操作过程采用Pulse Net标准操作手册规定进行。PFGE结果采用Bio Nu merics(Applied—maths公司，ver6.6)进行分析处理，采用UPGMA法进行聚类分析。

1.3 统计处理 数据统计计算用Excel 2007构建病原菌流行特征，分析统计耐药情况，采用SPSS 16.0软件进行统计分析。两组间比较采用卡方检验或者校正卡方检验，单向有序计数资料的变化趋势用趋势卡方分析，检验水准α＝0.05。

2 结 果

2.1 鼠伤寒沙门菌在婴幼儿腹泻人群中的流行病学特征

2.1.1 时间分布 2014－2018年，1 343份腹泻婴幼儿标本中，共检出178株沙门氏菌(13.25%)，其中鼠伤寒沙门菌检出72株(5.36%)。2014－2018年沙门菌(χ2趋势＝21.23，P＜0.01)和鼠伤寒沙门菌(χ2趋势＝16.02，P＜0.01)检出率均呈逐年上升趋势;5年间，鼠伤寒血清型在沙门菌中的占比亦呈逐年增高的趋势(χ2趋势＝18.47，P＜0.01)，2018年达到最高为62.50%，见表1。沙门菌全年均有检出，鼠伤寒沙门菌仅在2－11月才有检出，沙门菌检出高峰出现在6月(19.25%)，鼠伤寒沙门菌检出高峰出现在5月(8.16%)，5－10月沙门菌的检出率均处于较高水平，见图1。

表1 2014－2018年徐州地区婴幼儿腹泻人群中鼠伤寒沙门菌检出情况Tab.1 Detection of salmonella typhus in infant and infant diarrhea patients in Xuzhou region from 2014 to 2018

图1 2014－2018年患儿鼠伤寒沙门菌及沙门菌感染发病时间Fig.1 Onset time of salmonella typhus and salmonella infection in children from 2014 to 2018

2.1.2 年龄、性别分布 1 343例婴幼儿腹泻人群年龄范围为0 d～3岁，平均年龄1岁2个月，中位数为1岁4个月;72例鼠伤寒检出人群的年龄范围为:7 d～3岁，沙门菌和鼠伤寒沙门菌在1～3岁幼儿组的检出率均高于＜1岁婴儿组(χ2＝88.91，P＜0.01;χ2＝80.53，P＜0.01)(见表2);男患儿鼠伤寒检出率为54.9%(45/859)，女患儿为13.22%(27/484);男女病例之比为1.67∶1，检出率在性别间差异无统计学意义(χ2＝0.02，P＞0.05)。

2.1.3 临床感染特征和饮食史 1 343份腹泻患儿样本中，脓血便中鼠伤寒沙门菌的检出率为22.84%(37/162)，高于稀便的3.89%(13/334)、水样便的2.89%(12/415)、粘液便的2.62%(10/382)(χ2＝105.66，P＜0.01)，米泔样便、鲜血便和其他便未有检出鼠伤寒沙门菌。56.9%(41/72)的鼠伤寒感染患儿出现发热。经过餐饮史调查表明，48.6%(35例)阳检患儿为正常饭菜饮食，23.6%(17例)为混合饮食，12.5%(9例)为母乳喂养，15.28%(11例)为奶粉喂养。

表2 72株鼠伤寒沙门菌在婴幼儿腹泻人群中年龄分布Tab.2 Age distribution of 72 strains of salmonella typhimurium in infant diarrhea population

2.2 72 株鼠伤寒沙门菌耐药情况 药敏结果显示，耐药率＞90%的抗生素有:一代头孢类药和头霉素类、氨基糖苷类的阿米卡星，庆大霉素，妥布霉素;耐药率＞80%的抗生素有:青霉素类的氨苄西林、β-内酰胺酶抑制剂复合物中的氨苄西林/舒巴坦。耐药率＜10%的抗生素有:哌拉西林/他坐巴坦，厄他培南，亚胺培南，呋喃妥因，左氧氟沙星。产ESBLs表型阳性株对氨苄西林/他唑巴坦、头孢吡肟、氨曲南的耐药率高于非产ESBLs表型株(χ2＝4.57，P＜0.05;χ2＝38.66，P＜0.01;χ2＝45.53，P＜0.01)，单相变体的鼠伤寒沙门菌变种血清型(1，4，，12:i:－)和双相的鼠伤寒沙门菌血清型(1，4，12:i:1，2)之间的耐药特征差异均无统计学意义(P＞0.05)，详见表3。

表3 72株鼠伤寒沙门菌耐药情况[耐药数(%)]Tab.3 Drug resistance of 72 strains of Salmonella typhimurium[numberof drug resistance(%)]

A M-氨苄西林、A MS-氨苄西林/舒巴坦、TZP-哌拉西林/他唑巴坦、CFZ-头孢唑林、CTT-头孢替坦、CAZ-头孢他啶、CTR-头孢曲松、FEP-头孢吡肟、ATM-氨曲南、ETP-厄他培南、I MP-亚胺培南、AK-阿米卡星、GM-庆大霉素、TM-妥布霉素、CIP-环丙沙星、LEV-左氧氟沙星、F/M-呋喃妥因、SXT-甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。

2.3 耐药模型及多重耐药情况 65株(90.28%)鼠伤寒沙门菌为多重耐药菌，其中，30株(41.67%)为MDR，呈现XDR耐药的有35株(48.61%)，72株鼠伤寒沙门菌对18种抗生素的耐药谱呈37种模型;最多对9类14种抗生素耐药，详见表4。

表4 72株鼠伤寒沙门菌的多重耐药模型Tab.4 Model of multiple drug resistance of 72 strains of salmonella camphoris in mice

2.4 产ESBLs鼠伤寒的耐药表型及CTX-M各耐药基因检测 72株鼠伤寒沙门菌中，15株(20.83%)产ESBLs表型，其中13株携带CTX-M通用基因，3株来自2014年，2株来自2015年，8株来自2016年，2株来自2018年。对13株菌进行耐药基因扩增分型，结果显示4株blaCTX-M-1、9株bla CTX-M-9扩增结果阳性。对PCR产物进行测序，序列通过BLAST比对，发现分别与已知的blaCTX-M-1、blaCTX-M-9序列100%同源。CTXM-2组及CTX-M-8/CTX-M-25组扩增结果均为阴性，阴性对照成立。

2.5 PFGE图谱聚类分析结果 72株鼠伤寒沙门菌可分为66个PFGE带型，相似度在57.2%～100%之间变化，按照90%以上的相似度，可分为11个聚类。37株菌的相似度在90%～96.6%之间变化，包含多重耐药菌和非多重耐药菌;相同耐药谱的菌株之间带型相似度均＜80%;12株鼠伤寒沙门菌变种之间的PFGE图谱特征相似度＜80%;9株多重耐药鼠伤寒沙门菌出现4簇100%一致带型，其中1簇为2株2018年不同时间分离的鼠伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌变种，均为多重耐药菌。1簇为2017年5月13日分离的鼠伤寒沙门菌。1簇为分别于2016年、2018年分离的2株鼠伤寒沙门菌，1簇分别为2016年、2017年、2018年分离的3株鼠伤寒沙门菌。2株非多重耐药鼠伤寒沙门菌出现一簇100%一致带型，为分别于2017年5月和10月分离，详见图2。

2.6 院内感染流行病学调查 172例鼠伤寒患儿中，1例为2016年9月1日发现新生儿院内感染。对其父母亲、护理人员的粪便、手标本、产妇伤口、产道等样本进行连续3天病原检索，均未检出病原菌;产妇为剖宫产，近1周内无细菌感染史。2016年8月24日患儿出生时一切正常，于7天后出现哭闹不适，脓血便(11次/日);粪便培养检出鼠伤寒沙门菌。遂查看该医院同一病区近1个月内住院病人资料，2016年8月27－30日，同一病区有2例住院患者为鼠伤寒沙门菌感染。患儿发病后，医院加强消毒处理，医院外环境、护士标本中均未检出病原。综上，此例为婴儿出生后在院内发生的交叉感染。

3 讨 论

鼠伤寒沙门菌是目前世界各国分离率最高的沙门菌型之一，主要以儿童感染为主[10]，在我国临床感染沙门菌中27.4%是由鼠伤寒沙门菌引起的[11]。2014－2018年徐州地区婴幼儿腹泻人群中鼠伤寒感染率在沙门菌中的占比为40.45%，其中2018年高达62.50%，并呈逐年上升的趋势。和文献中儿童鼠伤寒感染数据范围(16.0%～68.6%)相比，处于较高水平[12-16]。0～3岁的腹泻人群中，以1～3岁幼儿年龄组检出率较高，相对于0～1岁的婴儿时期，幼儿的户外活动频繁，易食用不洁食品及饮品，感染的风险增加。本组研究中，最小婴儿发病年龄仅7 d，小于罗文雄[17]报道的36 d，经调查，本例为剖宫产后住院期间感染，其他地区亦出现鼠伤寒沙门菌引发的初生婴儿院内交叉感染报道[18]，提示初生婴儿院内感染的风险;因此，婴幼儿腹泻患者已成为该地区鼠伤寒沙门菌感染重点人群，今后应从饮食卫生和院内感染方面加以控制鼠伤寒沙门菌的污染。

图2 72株鼠伤寒沙门菌的PFGE图谱聚类分析Fig.2 Cluster analysis of PFGE map of 72 strains of salmonella typhus

脉冲场凝胶电泳(PFGE)现已被广泛用于多种病原体暴发流行、院内感染的溯源分析中。经过对72株鼠伤寒沙门氏菌进行PFGE分子分型研究显示，100%一致带型最多的有3株菌，无明显的优势带型。提示婴幼儿人群携带的鼠伤寒沙门氏菌基因型呈多样性，没有优势的流行基因型。此外，72株鼠伤寒沙门氏菌PFGE带型无3例以上的地域、时间的聚集性，反映鼠伤寒沙门氏菌在该地区婴幼儿人群中呈散发流行。值得关注的是，72株鼠伤寒沙门菌中，有9株多重耐菌出现4簇100%一致带型，提示多重耐药鼠伤寒菌株在婴幼儿人群存在小范围传播的可能。因此，仍需继续关注相关耐药菌的水平传播。

单相变体鼠伤寒沙门氏菌(1，4，[5]，12:i:－)是鼠伤寒沙门菌的一种血清型，定义为鼠伤寒沙门菌变种，已被证明与鼠伤寒沙门菌具有相似的毒力和耐药特征。本研究中检出12株鼠伤寒沙门变种，耐药情况产生了一致的结论。通过PFGE分子分型溯源，未发现单相变体血清型菌株出现聚集性趋势，但是样本量尚少，需要加大样本量，深入研究。

总体看来，徐州地区鼠伤寒沙门菌婴幼儿分离株的多重耐药形势严峻，呈现MDR和XDR的菌株共占比90.28%。ESBLs表型阳性株占20.83%，产ESBLs的菌株应避免使用青霉素类、头孢菌素类和氨曲南类药物。产ESBLs鼠伤寒沙门菌的耐药基因是以携带blaCTX-M-1和bla CTX-M-9亚型为主，亚型分布地区的差异与各地临床使用的抗菌药物不同有关。作为儿童治疗沙门菌感染的首选药物，三代头孢类的头孢他定(25.00%)和头孢曲松(37.50%)耐药率令人担忧，在近期的儿科感染使用中应加以控制，四代头孢类的头孢吡肟的耐药率目前低于20%，仍是头孢类最佳选择。哌拉西林/他唑巴坦及碳青霉烯类的厄他培南和亚胺培南目前耐药率仍呈现较低的水平，左氧氟沙星虽然耐药率较低(8.33%)，但是对儿童软骨发育有影响，仅用于治疗严重沙门菌或多耐药感染。

由于婴幼儿人群的鼠伤寒感染相关资料尚少，期望通过本研究能提高临床对鼠伤寒沙门菌感染及耐药性的认识，遏制儿科不合理抗生素应用。