通辽市家畜感染无形体属病原体的调查

吴东兴，娜仁格日乐，翟景波，白翠兰，吴七十三，包桂华

病原体分类学上蜱传立克次体病原体大多数归属于立克次体目的立克次体科和无形体科。无形体科的无形体属(Anaplasma)中主要包括中央无形体(A.centr ale)、牛无形体(A.bovis)、羊无形体(A.capr a)、嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophil um)。这些无形体均可感染牛、羊等家畜，嗜吞噬细胞无形体还可感染人的中性粒细胞引起人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis，HGA)[1]。HGA是1994年在美国首次报道的新发现人兽共患病[2-3]。蜱是无形体病原体主要传播媒介[4-8]，牛、绵羊、山羊、狗、马、人、鹿等动物可以是其宿主[9-12]。近10多年来，国内陆续有无形体感染人病例报道，并于2015年首次报道羊无形体感染人病例[13]。

人经携带无形体病原体的蜱叮咬后，经过1～2周潜伏期发病，主要临床表现为发热、身体乏力、头疼、肌肉酸疼、恶心、呕吐、腹泻等[14]。其临床症状有轻有重，很容易误诊为其他发热性疾病。内蒙古自治区地域广阔，对于蜱传病原体的种类、分布等相关研究极少。因此，本研究针对蜱传无形体属病原体，对通辽地区绵羊和牛的无形体属病原体感染状况进行调查，以便为这些病原体感染的预防和控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 家畜血液样本采集 2017－2018年在通辽地区双龙泉村(N44°31′27.53″;E120°34′18.95″)、香山镇(N44°28′56.15″;E120°37′20.43″)、东萨拉嘎查(N44°33′51″;E120°29′57″)、协代苏木镇(N43°52′15.76″;E123°01′34.75″)和珠日河嘎查(N43°51′117.39″;E122°14′30.42″)5个采集点，共对76只绵羊和20头牛颈静脉抽血，每只动物的血液样本放入普通EDTA抗凝管中保存，在管上注明标号，放置于4℃带回实验室备检。

1.2 血液DNA提取 采用QIAmap DNA Mini kit(QIAGEN)试剂盒，按照说明书步聚提取血液样本 DNA，QIAmap○RDNA Mini Kit(Qiagen)、乙醇、50×TAE、Agarose G-10、100 bp DNA Ladder、100 bp DNA Ladder、2×Taq PCR Master Mix、EB溶液等购于Solar bio有限公司。

1.3 引物合成 根据国内无形体科属病原体嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophil um)的特异性16S r RNA基因常规检测使用第1轮Eh-out1/Eh-out2引物和第2轮HGA1/HGA2引物是引用于参考文献[15-16]，新羊无形体(A.capr a)特异性16S r RNA基因引物是引用参考文献[17]，中央无形体(A.centr al)和牛无形体的特异性16S r RNA基因引物参考文献[18]。依据相关文献报道的嗜吞噬细胞无形体、羊无形体、中央无形体、牛无形体的基因扩增引物序列(表1)，委托北京六合华大基因科技有限公司合成相关PCR扩增引物。

1.4 PCR扩增 嗜吞噬细胞无形体16S r RNA和羊无形体glt A基因扩增使用了巢式PCR方法(nested PCR)，第1轮分别采用了Eh-out1和Ehout2、Aca G-OF1和Aca G-OR1引物，第2轮引物是HGA1和HGA2、Aca G-IF2和Aca G-IR2引物(表1);扩增条件为95℃变性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸1 min。中央无形体和牛无形体16S r RNA基因扩增使用巢式PCR方法，引物分别为AC1F和AC1R、AB1F和AB2R;扩增条件为95℃变性1 min、58℃退火1 min、72℃延伸1 min。PCR扩增后使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

表1 4种无形体的目的基因引物Tab.1 Target gene primers of four Anaplasma spp.

2 结 果

对内蒙古通辽地区农家散养的76只绵羊和20头牛做静脉采血和采用试剂盒对血样本提取DNA。使用巢式PCR方法对血液DNA样本分别进行羊无形体的特异性glt A基因及嗜吞噬细胞无形体、中央无形体和牛无形体的特异性16Sr RNA基因扩增。结果部分绵羊血DNA样本扩增出嗜吞噬细胞无形体(图1)和中央无形体的目的基因片段(图2)。17只扎鲁特旗香山镇绵羊样本扩增出嗜吞噬细胞无形体目的基因片段，阳性率85.0%(17/20);7只绵羊样本扩增出中央无形体的目的基因片段，阳性率为35.0%(7/20)。双龙泉村的9只绵羊样本扩增出嗜吞噬细胞无形体目的基因片段，阳性率为60.0%(9/15);3只绵羊样本扩增出中央无形体目的基因片段，阳性率为20.0%(3/15)。东萨拉嘎查的11只绵羊样本扩增出嗜吞噬细胞无形体目的基因片段，阳性率为52.4%(11/21);6只绵羊样本扩增出中央无形体目的基因片段，阳性率为28.6%(6/21);珠日河嘎查20只绵羊样本未能扩增到无形体属病原体16S r RNA和glt A基因片段(表2)。并且，76只绵羊样本均未扩增到新羊无形体glt A基因和牛无形体16Sr RNA基因片段，20头牛样本均未扩增到4种无形体的目的基因片段。本次研究通辽地区绵羊的嗜吞噬细胞无形体总感染率为48.7%(37/76)，中央无形体总感染率为21.1%(16/76)。

图1 绵羊血DNA样本中扩得的嗜吞噬细胞无形体16S r RNA基因片段电泳图Fig.1 Electrophoregram of A.phagocytophilum 16S r RNA gene fragment amplified from sheep blood DNA sample

图2 绵羊血DNA样本中扩得的中央无形体16Sr RNA基因片段电泳图Fig.2 Electrophoregram of A.centr ale 16S r RNA gene fragment amplified fromsheep blood DNA sample

表2 通辽地区绵羊和牛的4种无形体感染率(%)Tab.2 Four Anaplasma spp infection r ates of sheep and cattle in Tongliao area(%)

3 讨 论

我国2015年人感染无形体病例首次在Lancet Inf ectious Diseases上报道[17]。2012年国内报道了蜱传播三仓新埃立克体(Candidatus Neoehrlichia mikurensis)感染[19]。除了新发无形体病外，内蒙古地区还有-布鲁菌病等人兽共患病流行[20]。但是，通辽地区的无形体感染牛、羊未见文献报道。本研究对通辽地区家畜动物牛、羊携带无形体属病原体(嗜吞噬细胞无形体、中央无形体、牛无形体、羊无形体)的感染进行调查研究。首次从通辽市北部山地草原扎鲁特旗的绵羊检测到嗜吞噬细胞无形体和中央无形体，扎鲁特旗处于通辽市西北部，大兴安岭南麓，属内蒙古高原向松辽过渡地带，也是山地草原散放牧区，蜱虫生息的自然条件优越地带。因此，该地区的牛、羊易被携带无形体感染的蜱叮咬而被感染。然而，通辽地区中南部科尔沁左翼中旗地区牛、羊均未能检测到无形体病原体，原因可能是该地区主要是农业为主，而每年禁牧，牛、羊散放于牧场的时间比较短，从而使牛、羊接触蜱的机会少，该平原草地分布蜱虫的种类不同，其携带病原体也不同。

本次研究首次发现扎鲁特旗绵羊携带无形体属嗜吞噬细胞无形体和中央无形体病原体，并解释阐明了内蒙古通辽地区潜在的传染病。因此有必要对该地区宿主动物携带无形体属病原体、蜱虫种类，以及这2种无形体对人感染率做进一步的调查研究，为预警与防控未来突发传染病提供科学依据。