基于电化学生物传感器的设计及在肿瘤遗传物质检测中的研究进展

马霄，谢宝鲜

1 杭州市第一人民医院设备科 （浙江杭州 310006）；2 杭州市肿瘤医院肿瘤外科 （浙江杭州 310002）

癌症或称恶性肿瘤，是目前人类最主要的死亡原因，并已成为严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病[1]。一部分癌症患者可以得到有效的控制或治愈，而早期诊断是提高癌症患者治愈率最有效的手段[2]。肿瘤标志物是指在癌症发生时由肿瘤细胞本身或人体自身应对反应而产生的一类物质，存在于肿瘤组织、血液、体液和排泄物中, 包括遗传物质、酶和代谢物等多种成分[3]。遗传物质即核酸，是由核苷酸聚合成的生物大分子化合物, 也是生命的最基本组成物质，按照化学成分组成的不同分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid, RNA）[4-5]。

电化学生物传感器是近些年来备受关注的新型生物传感器，具有较高的灵敏度、较好的选择性等优点，建立电化学生物传感方法对肿瘤遗传物质标志物的检测具有重要意义[6]。电化学生物传感器检测遗传物质，是以遗传物质为敏感元件或检测对象，通过换能器将遗传物质特异性识别过程中产生的信号转化为电信号，从而实现定性或定量检测；此外，电化学生物传感器在对肿瘤遗传物质样本检测的重复再生和循环杂交方面具有良好的重复性和稳定性，已成为目前肿瘤患者早期临床诊治和药物指导的强大工具[7]。本研究拟从电化学生物生物传感器着手，总结近年来遗传物质探针的设计和实施思路, 从而为检测肿瘤遗传物质标志物提供有意义的方法。

1 电化学生物传感器在肿瘤遗传物质标志物构建中的策略

电化学生物传感器以电极为生物样品识别元件和适当的理化换能器，生物活性物质（如遗传物质、细胞、组织、抗原抗体、酶和微生物等）固定在电极上，通过生物分子之间的特异性识别作用将待测物质与其反应的信号转化为可以识别的电信号，从而实现对待测物质的定性或定量检测。

探针的选择及固定、信号放大材料的应用和电化学修饰技术是提高肿瘤遗传物质标志物检测灵敏度的关键（图1）。

图1 电化学生物传感器的设计及在肿瘤遗传物质中的检测流程图

2 DNA 肿瘤标志物及其电化学检测应用

2.1 单核苷酸多态性

基因组序列差异有多种，如碱基插入、缺失、单核苷酸多态性（single nucleo-tide polymorphism，SNP）及微卫星等，SNP 只是其中最普遍的一种，在临床上有重大的意义。SNP 在基因组中分布广泛，有研究表明，SNP 在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP 位点，使人们有机会发现各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变。如KRAS，BRAF，BRCA1和EGFR 这些基因在许多肿瘤类型中均具有较高的突变频率，且与癌症的进展有关，是重要的生物标志物。

Jagotamoy Das 等[8]首次在不需要酶放大的情况下成功检测无细胞核酸（cell free nucleoacid，cfNA），并成功应用到肺癌和黑色素瘤患者检测中。Dr. Jagotamoy Das 等[9]利用组合探针（型号：CPs）直接检测患者血清中有突变的基因。L.A.Gugoasa 等[10]利用铂和二氧化钛改性的石墨烯粉末修饰传感器表面，用于检测P53、KRAS 和CEA 结肠癌生物标志物，得到的测定限低，灵敏度高的生物传感器用于结肠癌早期筛查。

BoSitu等[11]首先利用透射电镜、电化学阻抗谱和循环伏安法对合成的复合纳米修饰粒子进行了表征，再利用双重扩增策略研制了一种用于结直肠癌细胞BRAF V600E突变检测的电化学生物传感器，该方法制备的传感器具有灵敏度高、操作简单、成本低、检测方法容易验证等优点，为复杂肿瘤样品中其他罕见突变的分析奠定了基础。Xiangzhao Ai等[12]利用“纳米-微”技术研制了一种简单、灵敏、快速的基于量子点的多重遗传物质生物传感器，实现了BRAF和BRCA的同时检测。

AbhayVasudev 等[13]提出了一种电化学传感器，将抗EGFR 抗体固定在二硫代双琥珀酰亚胺基丙酸酯自组装单层膜（self-assembled monolaye，SAM）修饰的金电极上，实现了EGFR 的无标记检测。HodaIlkhani 等[14]将生物素化的抗人表皮生长因子受体固定在链霉亲和素包裹的磁珠（ferrite bead，fb）上作为捕获探针，并将多克隆抗人表皮生长因子受体抗体与柠檬酸盐包裹的金纳米粒子偶联作为信号探针，在最佳条件下，EGFR 传感器的动态浓度范围为1～40 ng/ml，最低检测限为50 pg/ml，相对标准偏差＜4.2%。

2.2 循环肿瘤细胞DNA

循环肿瘤基因（循环肿瘤DNA）是指肿瘤细胞体细胞DNA 经脱落或当细胞凋亡后释放进入循环系统，是一种特征性的肿瘤生物标记。循环肿瘤细胞DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是一种特征性的肿瘤生物标记物，来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是其存在于体内每个细胞，可以被定性、定量和追踪。通过ctDNA 检测能够检出血液中的肿瘤踪迹，所以ctDNA 已被证实为乳腺癌、黑色素瘤、大肠癌、肺癌等癌症的生物遗传物质标志物。

SufenWang 等[15]采用循环伏安法研究了肿瘤抗生素与ctDNA 在溶液中的相互作用，通过不可逆电活性分子与ctDNA 结合的电化学方程，建立了蒽醌类化合物与肿瘤的相关联系。

3 RNA 肿瘤标志物及其电化学检测应用

RNA 是由核糖核苷酸（一个核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和碱基构成）经磷酯键缩合而成的长链状分子，能动态反映细胞状态，是监测癌症的重要肿瘤标志物。

3.1 信使RNA

信使RNA（mRNA）是以DNA 的一条链为模板，以碱基互补配对原则转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达。

R.M.Torrente-Rodríguez[16]报道了采用电化学磁生物传感器同时测定未稀释唾液标本中两种与涎腺口腔癌相关的生物标志物IL-8及其信使RNA（IL-8 mRNA）的研究进展。细胞内凋亡抑制蛋白Survivin mRNA 已成为早期准确诊断肿瘤的重要生物标志物，Jing Liu 等[17]根据DNA 末端二茂铁与survivin mRNA 反应后和电极表面电子转移效率的变化，设计了一种可切换的survivin mRNA 电化学传感器。

3.2 长链非编码RNA

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）表观遗传学主要机制包括DNA 甲基化、组蛋白修饰及新近发现的非编码RNA，使研究基因表达发生了可遗传的改变，对细胞的生长分化及肿瘤的发生发展至关重要。

Fei Liu 等[18]制备了基于单壁碳纳米管包裹金-铑空心纳米球的修饰策略，产生了催化放大信号，该生物传感器明显增强了lncRNA 的催化作用，并提供了超灵敏的检测。Liu 等[19]研制了一种基于纳米金多面体聚酰胺-胺树枝状大分子的肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis-associated lungadenocarcinoma transcript 1，MALAT1）检测新策略，采用多壁碳纳米管和纳米金复合物作为捕获探针固定化基质，纳米金聚酰胺胺树枝状大分子作为检测探针的跟踪标记，该方法具备较强的表面结合捕获探针能力，该生物传感器对MALAT1具有超灵敏的检测作用及显著的催化作用。其中MALAT1是一种存在于血清中的lncRNA，是检测肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的重要生物标志物，结果表明该技术在临床肝癌诊断中具有潜在的应用价值。

3.3 微小RNA

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类内生的、长度约20～24个核苷酸的小RNA，几个miRNA 可调节同一个基因，且在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，引起越来越多研究人员的关注。有研究表明，两个miRNA 水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关提示miRNA 和癌症之间可能存在潜在关系。

Mostafa Azimzadeh 等[20]提 出 了 一 种 用 于miR-155等离子体检测的新型电化学纳米生物传感器，基于在玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）表面修饰的氧化石墨烯（GO）片上的巯基化探针功能化金纳米棒（gold nanorods，GNRs）电化学信号与靶miRNA 浓度在2.0 fm～8.0 pm 呈线性关系，检测限为0.6 fm，这种纳米生物传感器具有很高的特异性，能够快速鉴别互补、非互补、单碱基错配、三碱基错配的miRNA。

4 展望

近年来，高通量测序技术得到了广泛的应用，越来越多的肿瘤遗传物质被发现，并在精准诊疗和用药指导上发挥了不可替代的作用。电化学技术是一门交叉学科的综合技术，在肿瘤检测及临床药物等方面得到了广泛应用，新的电化学修饰方法和新材料的应用也使电化学生物传感器得到了快速发展，将电化学生物传感技术应用到肿瘤检测方向一定会有更长足的发展。