粪便菌群移植通过调节Th17/Treg平衡发挥对帕金森小鼠的保护作用*

叶明, 张丽娜, 谢静, 时鹏, 刘晓林

(蚌埠医学院第一附属医院，安徽 蚌埠 233004)

帕金森病(prkinson's disease，PD)是一种基底神经节运动障碍性疾病[1-2]，其病因非常复杂[3-4]，通常在PD运动障碍症状出现之前PD患者脑内黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)中多巴胺能神经元就已经丢失[5]，这一特征与其多因素病因相结合，阻碍了针对该疾病进展的适当疗法的发展[6]。研究表明，Th17/Treg细胞功能的失衡可加重PD的进程[7]。临床研究发现，在运动障碍发生之前往往会伴随便秘等胃肠道功能障碍[8]，提示PD的发生可能与粪便菌群失调相关。Zhou等[9]的研究证明，粪便菌群能够通过增加PD小鼠的多巴胺(dopamine，DA)水平或功能而发挥其神经保护作用，另有报道称粪便菌群能调控Th17/Treg平衡[10]。因此，基于以上研究，本文拟通过采用粪便菌群移植治疗PD小鼠，探讨粪便菌群是否能够通过调节Th17/Treg平衡发挥对PD小鼠的神经起保护作用，以期为临床应用菌群移植法治疗PD提供理论研究基础和新方向。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要药物与试剂 MPTP(阿拉丁试剂)、抗生素(美仑生物)，小鼠DA、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、白介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)、白介素-22(interleukin-22，IL-22)、转化生长因子(transforming growth factor β，TGF-β)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)ELISA检测试剂盒(武汉优尔生)，Th17细胞特异性转录因子维甲酸相关孤儿受体(retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)抗体(武汉博欧特)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、羊抗兔IgG-HRP、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Treg细胞特异性转录因子叉头状转录因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)、β-actin抗体(万类生物)，TRIpure、Super M-MLV反转录酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物)，SYBR Green、抗荧光淬灭剂(北京，Solarbio)，PVDF膜(美国，Millipore)、预染蛋白分子量标准(加拿大，Fermentas)、脱脂奶粉(伊利实业)、CD4荧光抗体(美国，NOVUS)、FOXP3荧光抗体(美国，Santa)、RORγt荧光抗体(美国，Thermo Fisher)，FITC标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记山羊抗兔及Cy3标记山羊抗大鼠IgG、DAPI(碧云天生物)。

1.1.2动物 6周龄健康雄性C57小鼠，体质量(22±1)g(辽宁长生生物科技股份有限公司)。

1.1.3主要仪器 显微镜拍照系统(DP73，OLUMPUS)、显微镜(OLUMPUS，BX53)、水平摇床(WD-9405B，北京六一)、微量移液器(Proline，BIOHIT)、超纯水系统(NW10LVF，Heal Force)、电泳仪(DYY-7C，北京六一)、转移槽(DYCZ-40D，北京六一)、酶标仪(ELX-800，BIOTEK)、电热恒温培养箱(DH36001B，天津泰斯特)、真空干燥箱(DZF-6050，SYSBERY)、荧光定量PCR仪(Exicycler 96，BIONEER)、紫外可见分光光度计(上海佑科，型号UV752N)。

1.2方法

1.2.1实验分组 将18只小鼠适应性喂养1周，昼夜各12 h，温度(22±1)℃，湿度45%～55%，自由饮食。随机均分为正常对照组、粪菌移植对照组、粪菌移植组，每组6只。

1.2.2制作PD模型 造模前9 d，后两组小鼠每日予200 μL抗生素混合物(1 g/L杆菌肽+0.5 g/L庆大霉素+0.2 g/L环丙沙星+1 g/L新霉素+1 g/L青霉素+1 g/L甲硝唑+0.5 g/L头孢他啶+0.5 g/L万古霉素+2 g/L链霉素)灌胃，持续7 d后停止灌胃2 d。造模开始，将MPTP溶于无菌生理盐水中按照每公斤体质量20 g/10 L的剂量对粪菌移植组及移植对照组小鼠腹腔注射，每隔2 h注射1次，共4次，建立PD模型；正常对照组注射等量生理盐水。

1.2.3粪便菌群移植 PD模型造模后第2天开始每日收集正常对照组小鼠的新鲜粪便颗粒，同天收集的所有粪便颗粒立即用无菌PBS(1个粪粒/mL)浸泡15 min，摇匀后4 ℃离心5 min，取悬浮液继续离心洗涤，将最终的菌悬液以40 %无菌甘油稀释至终浓度为20 %，每天取200 μL菌悬液(约含1011CFU/L)对粪菌移植组小鼠灌胃1次，共7 d。粪菌移植对照组采用等剂量PBS与甘油的混合物灌胃。

1.2.4行为学训练 MPTP给药后第5天，制作一个直径为1 cm、长0.5 m并且顶端固定有一个直径为2 cm的球形突起的杆，并且缠上纱布，杆竖直放置，小鼠头朝下放到爬杆顶端的小球上进行爬杆训练；将小鼠的前爪放在水平绳索上进行牵引训练，每天1次，连续3 d。

1.2.5爬杆实验评价各组小鼠行动能力 训练完成后进行正式实验，记录小鼠从开始运动到返回杆底部的时间，对每只鼠进行3次实验，每次间隔5 min，取平均值进行统计[9-11]。

1.2.6牵引实验评价各组小鼠的肌肉力量及平衡能力 训练完成后将小鼠的前爪放在水平绳索上观察10 s，后肢的放置位置评分为1～4分，最低分表示最严重的缺陷。评分标准：动物用两只后爪抓绳子的得4分，一只后爪抓绳子得3分，两只前爪抓绳子得2分，一只前爪抓绳子为1分；每只小鼠进行3次实验，每次间隔5 min，取平均值进行统计[9-11]。

1.2.7实验取材 行为学实验完成后，处死各组小鼠，收集外周血分离血清、同时取小鼠纹状体组织及SNpc进行后续实验。

1.2.8检测小鼠SNpc中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表达 采用Real-time PCR，收集各组小鼠SNpc组织样本，提取总RNA、测定RNA浓度及纯度；并反转录成cDNA，以cDNA为模板，β-actin为内参，按照下述体系及条件进行相对定量检测：体系为cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，SYBR GREEN 0.3 μL，dd H2O补足至20 μL；反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环后，于72 ℃ 2 min 30 s，40 ℃ 1 min 30 s。引物序列如表1所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.9SNpc中ROR-γt、Foxp3蛋白的表达 采用Western blot，按照全蛋白提取试剂盒说明书提取样本总蛋白，测定蛋白浓度后，按照蛋白条带大小配置浓缩胶与分离胶行SDS-PAGE电泳，电压80 V，恒压电泳2.5 h；转膜后用脱脂奶粉封闭，然后一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育45 min。行ECL底物发光后暗室曝光，之后行抗体剥脱，再次封闭后孵育内参抗体，ECL底物发光后暗室曝光，最后将所有胶片进行扫描后分析目标条带的光密度值。

1.2.10纹状体中DA、5-HT及外周血与SNpc中IL-17A、IL-22、IL-10、TGF-β的表达 分别按照试剂盒说明书步骤检测小鼠纹状体中DA、5-HT及外周血与SNpc中IL-17A、IL-22、IL-10、TGF-β的含量。

1.2.11SNpc中Th17/Treg细胞的表达 制备SNpc组织样本石蜡切片后行免疫荧光双染色，将切片经脱蜡至水进行抗原修复，采用CD4、Foxp3、RORγt荧光抗体共同4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育90 min后进行DAPI染细胞核，最后滴加抗荧光淬灭剂，盖玻片封片。于荧光显微镜下观察染色效果，于400×镜下拍照。

1.3统计学分析

2 结果

2.1爬杆实验和牵引实验结果

爬杆实验结果显示，粪菌移植对照组小鼠的运动能力明显降低，较正常对照组小鼠返回到杆底部的时间明显延长(P<0.01)；与粪菌移植对照组比较，粪菌移植组小鼠完成爬杆实验的时间明显缩短(P<0.01)，见图1。牵引实验结果表明，粪菌移植对照组小鼠较正常对照组小鼠得分明显降低(P<0.01)；与粪菌移植对照组比较，粪菌移植组小鼠的得分增加(P<0.01)，见图2。

注：(1)与正常对照组比较，P<0.01；(2)与粪菌移植对照组比较，P<0.01。图1 各组小鼠爬杆实验结果Fig.1 Results pole-climbing test in each group

注：(1)与正常对照组比较，P<0.01；(2)与粪菌移植对照组比较，P<0.01。图2 各组小鼠牵引实验结果Fig.2 Results traction test in each group

2.2SNpc中ROR-γt、Foxp3 mRNA表达

与正常对照组小鼠相比，粪菌移植对照组小鼠SNpc中ROR-γtmRNA和蛋白表达水平明显上调(P<0.01)；但与粪菌移植对照组相比，粪菌移植组小鼠ROR-γtmRNA和蛋白的表达明显下调(P<0.01)。与正常对照组小鼠相比，粪菌移植对照组小鼠SNpc中Foxp3 mRNA表达水平明显下调(P<0.01)；与粪菌移植对照组小鼠相比，粪菌移植组小鼠Foxp3 mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.01)，见图3和图4。

注：(1)与正常对照组比较，P<0.01；(2)与粪菌移植对照组比较，P<0.01。图3 各组小鼠SNpc中Foxp3及RORγt mRAN的表达Fig.3 Expression of Foxp3 and RORγt mRNA in SNpc of each group

2.3纹状体中DA与5-HT含量

如图5所示，与正常对照组相比，粪菌移植对照组小鼠纹状体内DA及5-HT的含量明显降低(P<0.01)；与粪菌移植对照组相比，粪菌移植组小鼠纹状体内DA及5-HT的含量明显升高(P<0.01)。表明粪便菌群移植对PD具有一定的保护作用。

注：(1)与正常对照组比较，P<0.01；(2)与粪菌移植对照组比较，P<0.01。图4 各组小鼠SNpc中Foxp3及ROR-γt蛋白表达Fig.4 Expression of Foxp3 and ROR-γt protein in SNpc of each group

2.4外周血及SNpc中IL-17A、IL-22、IL-10及TGF-β含量

与正常对照组相比，粪菌移植对照组小鼠的外周血及SNpc中Th17细胞相关促炎细胞因子IL-17A及IL-22明显上调(P<0.01)，而Treg细胞相关抗炎细胞因子IL-10及TGF-β的含量明显下调(P<0.01)；与粪菌移植对照组相比，粪菌移植组小鼠的IL-17A与IL-22的含量明显下调(P<0.01)，IL-10与TGF-β明显上调(P<0.01)，见图6。

注：(1)与正常对照组比较，P<0.01；(2)与粪菌移植对照组比较，P<0.01。图5 各组小鼠纹状体中DA与5-HT的含量Fig.5 Contents of DA and 5-HT in the striatum of each group

注：(1)与正常对照组比较，P<0.01；(2)与粪菌移植对照组比较，P<0.01。图6 各组小鼠外周血及SNpc中IL-17A、IL-22、IL-10及TGF-β的含量Fig.6 Contents of IL-17A, IL-22, IL-10 and TGF-β in peripheral blood and SNpc of each group

2.5SNpc中Th17/Treg细胞平衡

结果显示，与正常对照组相比，在粪菌移植对照组及粪菌移植组小鼠中有较多的Th17细胞(RORγt+CD4+)侵入到SNpc中；而相较于Th17细胞，Treg细胞仅有少量的表达。与粪菌移植对照组相比，在粪菌移植组小鼠SNpc中Th17细胞(RORγt+CD4+)的数量有所下调，而Treg细胞(Foxp3+CD4+)的数量有所上调，见图7。

注：A为Th17细胞表达结果，B为Treg细胞表达结果。图7 各组小鼠SNpc中Th17及Treg细胞的表达(IF，×400)Fig.7 Expression of Th17 and Treg cells in SNpc of each group (IF，×400)

3 讨论

PD作为一种常见的神经退行性疾病，其发病机制复杂多样[12-13]。炎症反应是PD的发病机制之一[14]，其中起最显著作用的是T细胞[15-16]。已有研究证明，在神经元变性过程中，CD8+和CD4+T细胞能侵入MPTP诱导的小鼠PD模型的大脑中[17-18]。在本研究中确认了MPTP诱导PD的相关特征，包括运动和行为损伤以及黑质纹状体DA及5-HT含量的下降。重要的是，本研究通过免疫荧光双染结果观察到CD4+T细胞在PD小鼠的SNpc中增加。更直接的证据表明，PD小鼠SNpc中Th17细胞数量增加，而Treg仅有较少量的表达，表明Th17细胞迁移并积聚在PD小鼠受损的脑实质中。Th17与Treg细胞分别主要与促炎和抗炎作用相关。侵入到脑实质内的Th17细胞通过释放炎性细胞因子如IL-17和IL-22来促进胶质细胞的活化，而过度活化的胶质细胞在PD动物受损的大脑区域释放更多的炎性介质和更少的神经营养因子，进而产生神经毒性，最后对神经元造成直接损伤[19-20]。此外，Treg可以通过释放抗炎因子如IL-10及TGF-β等调节炎症反应，抑制上述过程，促进MPTP中毒后神经元的存活[21-22]。因此识别CD4+T细胞的不同亚群，调控Th17/Treg细胞的平衡对于PD及其他炎症性疾病具有重要意义。

据报道，粪便菌群的移植在PD、高血压、肌萎缩侧索硬化症[23]、炎症性肠病[24-25]等疾病中均发挥重要作用。本研究证明，在PD小鼠外周血及SNpc中促炎因子表达上调，抗炎因子表达下调。而在将正常小鼠的粪便经过一系列处理后获得的微生物群给予PD小鼠灌胃后，小鼠的PD样行为、纹状体中DA及5-HT及炎症因子的含量被逆转。并且使Th17/Treg功能被调控到相对平衡的状态。综上所述，通过粪便菌群移植的方法可调控Th17/Treg细胞反应的平衡，而不是针对促进中枢神经系统抗原的自动反应性免疫，实际上是在诱导保护性的T细胞反应，而不会由于引起炎症反应导致神经元损伤的二次加重。因此这种采用粪便菌群移植来保护PD神经损伤的治疗方法具有十分重要的科学意义。