细胞培养密度对乳腺癌4T1细胞增殖、迁移、黏附及浸润能力的影响*

陈腾祥，孙密欣,2，肖俊，董宇华，熊英，兰金芝，雷珊，张金娟**

(1.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550025；2.河北省邯郸市第一医院 中心实验室，河北 邯郸 056000；3.贵州医科大学 生物与工程学院, 贵州 贵阳 550025)

乳腺癌(breast cancer)是常见的女性恶性肿瘤，其发病率和死亡率均呈逐年上升趋势[1-2]。调查显示，乳腺癌位居女性癌症发病率的第1位、病死率的第2 位[3]，严重影响女性身心健康。目前临床手术治疗、放化疗等治疗方案在不断改进，使得乳腺癌患者5年生存率有所提高[4-5]。乳腺癌的生存率依然不容乐观，这主要与乳腺癌的转移复发有关[6]。癌组织的微环境是影响癌细胞转移复发的重要因素[7-10]，癌细胞的增殖能力越强，癌组织在短期内的细胞数也就也多，细胞的生存密度也就越大，细胞的生存密度是癌组织发展的重要因素之一[11-13]。细胞密度因素对于癌组织的发生发展的影响，目前文献报道不多，为了解细胞密度对癌细胞增殖和转移能力的影响，本研究以4T1乳腺癌细胞作为研究对象，以60%和90%的细胞培养汇合度来模拟癌细胞的高密度或低密度的生存环境，通过增殖、迁移、黏附和浸润等实验评估癌细胞的增殖及转移能力。

1 材料与方法

1.1实验材料

4T1小鼠乳腺癌细胞株购自广州市吉妮欧生物科技有限公司，CO2恒温培养箱(Model 310型)购于美国Thermo公司，超净工作台(SW-CJ-2FD)购于苏州净化设备有限公司，倒置显微镜(CKX41)购于日本Olympus公司，离心机(Allegar 64R)购于美国Beckman公司，酶标仪购于美国BioTek公司，DMEM(高糖)培养基购于美国Hyclone公司，胎牛血清购于美国Gibco公司，胰酶粉剂购于北京索来宝公司，细胞培养板(96孔、24孔、12孔)购于中国无锡耐思生物科技有限公司，Transwell小室购于美国Millipore公司，Matrigel胶购于美国DB公司，吉姆萨染色剂和MTT试剂盒购于北京索来宝公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 4T1乳腺癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基，于37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞长至对数生长期，将细胞接种于6 cm培养皿中。培养至汇合度为60%(sparse组)和90% (dense组)，如图1所示，分别取高密度和低密度培养的4T1细胞进行后续实验。

1.2.2细胞克隆实验 经高密度和低密度培养的4T1细胞，分别制备成2×105个/L的单细胞悬液，以1 mL/孔将细胞接种于24孔板，继续培养至肉眼可见细胞集落时，吉姆萨染色，显微镜下观察并计数(每孔随机选取5个视野)，实验重复3次。

sparse(汇合度约60%) dense(汇合度约90%)图1 高、低密度培养的乳腺癌4T1细胞(100×)Fig.1 4T1 breast cancer cells cultured in low and high density(100×)

1.2.3划痕实验检查细胞迁移率 高密度和低密度培养的4T1细胞，制成9×108个/L的细胞悬液，以每孔3 mL接种于6 cm培养皿中培养过夜、细胞铺满，用200 μL枪头在单层细胞上呈划“一”字痕，漂洗去除悬浮细胞，换成不含血清的DMEM，于0 (即刻)、6、12和18 h时在倒置显微镜下观察和拍照，用photoshop软件测量划痕宽度，算出细胞迁移距离，计算细胞迁移率。细胞迁移率=(初始划痕宽度-检测时宽度)/初始划痕宽度，实验重复3次。

1.2.4Transwell小室实验观查细胞迁移率 取高密度和低密度培养的4T1细胞，分别制成单细胞悬液(2×108个/L)；取细胞悬液200 μL加入Transwell小室，下室为全培养基600 μL；培养18 h后，取出Transwell小室，擦除室内残余细胞，甲醇固定膜外细胞，吉姆萨染色，倒置显微镜下观察并拍照，每孔取5个视野进行统计。迁移率=测试组跨膜细胞/对照组跨膜细胞 ×100%，实验重复3次。

1.2.5黏附实验计算细胞相对黏附率 取高密度和低密度培养的4T1细胞，分别制成单细胞悬液(2×108个/L)，以100 μL/孔加入预铺了BSA的96孔板中(设3个空白孔)，培养60 min，漂洗掉未黏附的细胞。加入含5%MTT的DMEM 120 μL，37 ℃孵育3 h，弃上清，加入DMSO震荡10 min，在酶标仪上570 nm处OD值，扣除空白对照组背景，以dense组细胞孔OD值为相对值，计算细胞相对黏附率，实验重复3次。

1.2.6浸润实验 取高密度和低密度培养的4T1细胞，分别制成单细胞悬液(4×108个/L)，将细胞铺到Traswell小室的Matrigel(预先制备)上，下室为含5%FBS的DMEM，培养24 h，擦除小室内的Matrigel和细胞。固定漂洗后，吉姆萨染色，倒置显微镜下观察和拍照(每孔取5个视野)，实验重复3次。

2 结果

2.1细胞克隆实验结果

与sparse组比较，dense组的4T1细胞形成克隆数目明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)，且形成的单个克隆面积更大。见图2。

注：A为肉眼所见，B为镜下所见；(1)与sparse组比较，P<0.01。图2 细胞培养密度对乳腺癌4T1细胞克隆形成的影响Fig.2 The effect of cell culture density on the colony formation of 4T1 breast cancer cells

2.2细胞迁移率

划痕实验结果显示，与sparse组比较，dense组的4T1细胞更快地迁移覆盖划痕处；划痕18 h后，dense组细胞的迁移率为(87±6)%，显著高于sparse组细胞的迁移率(48±12)%，差异有统计学意义(P<0.01，图3)。与sparse组细胞比较，dense组细胞穿过Transwell小室碳酸脂膜的细胞数显著增多，以dense组4T1细胞的迁移率为100%，sparse组4T1细胞迁移率为(19±6)%，差异有统计学意义(P<0.01，图4)。

注： A为高、低密度培养来源的4T1细胞划痕愈合情况，B为统计学处理结果；(1)与sparse组比较，P<0.01。图3 划痕实验检测细胞培养密度对乳腺癌4T1细胞迁移能力的影响Fig.3 The effect of cell culture density on migration of 4T1 breast cancer cells evaluated by wound healing assay

注：A为高、低密度培养来源的4T1细胞Transwell跨膜迁移情况(吉姆萨染色，×200)，B为统计学处理结果；(1)与sparse组比较，P<0.01。图4 Transwell实验检测细胞培养密度对乳腺癌4T1细胞迁移能力的影响Fig.4 The effects of cell culture density on the migration capacity of 4T1 breast cancer cells tested by Transwell migration assay

2.3细胞的黏附率和浸润能力

以 dense组的细胞粘附率作为100%，sparse组细胞的黏附率为(39±24)%，差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell细胞浸润实验显示，dense组细胞穿过Matrigel基质胶和小室碳酸脂膜的细胞数明显增多，差异有统计学意义(P<0.01，图5)。表明经过高密度培养的细胞获得了更强的黏附和迁移能力。

注：A为dense和sparse组的4T1细胞相对黏附率，B为Transwell-Matrigel浸润细胞图(吉姆萨染色，×100)，C为Transwell-Matrigel实验浸润细胞计数直条图；(1)与sparse组比较，P<0.05。图5 细胞培养密度对乳腺癌4T1细胞的黏附和浸润能力的影响Fig.5 The effect of cell culture density on the adhesion and invasion of 4T1 breast cancer cells

3 讨论

在癌症发生发展的过程中，癌细胞的增殖和转移是不同的生物学过程，这两个过程可以同时发生，也可以在不同的时期和环境中单独发生或依次发生[14-15]。随着癌细胞的增殖和组织中细胞密集，会使微环境发生相应变化，反过来会对癌细胞的发生发展产生影响[16-17]。对于具有高转移能力的癌细胞，在高密度的环境下，其增殖和转移能力是否都得到了提高，是值得关注的问题。

4T1细胞是来源于BALB/c小鼠种系的乳腺癌细胞株，具有高度的成瘤性和转移性，其在小鼠体内形成的移植瘤和转移病灶被认为是临床4期人乳腺癌的理想动物模型[18-19]，为了探讨具有高度转移特性的4T1乳腺癌细胞在体外的增殖和转移能力是否受细胞密度的影响，本研究检测了经过高、低密度培养的4T1细胞的增殖、克隆形成、迁移、浸润和黏附能力，结果发现，经过高密度培养后，上述能力均有所提高。这与文献[20]的研究结果一致，他们利用3D培养技术对纤维肉瘤细胞株HT1080进行高、低密度培养，结果发现，高密度培养的HT1080迁移和增殖能力更强。利用低成瘤性和低转移性的MCF7和WI-38进行观察，细胞培养密度对这些细胞的增殖、迁移和浸润能力的影响并不明显。这些结果说明高转移性的癌细胞在高速增殖后，即启动了转移的程序。然而，为什么高转移性的癌细胞获得了这种能力，这可能有缺氧、营养缺乏、局部组织液的酸化或旁分泌的微环境影响，也可能有关键基因变异或表观遗传学的变化，这些还有待深入研究。