HPLC同时测定附子理中丸（大蜜丸）中果糖和葡萄糖的含量

武红娜，王晓琦，潘海霞

（沧州市食品药品检验所，河北 沧州 061000）

附子理中丸是甲类非处方药，出自宋代《惠民药局方》，具有温中健脾的功效，用于脾胃虚寒、脘腹冷痛、手足不温等症[1-4]，临床应用广泛。目前，附子理中丸有大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸和浓缩丸4种剂型，其中大蜜丸、小蜜丸和水蜜丸3种剂型均收载于《中国药典》2015年版一部 ，由附子（制）、干姜、炒白术、党参和甘草5味药加炼蜜制成[1]。

炼蜜是由蜂蜜炼制而成，作为蜜丸中常用的辅料，据调查目前市场上不排除存在劣质蜂蜜制丸的现象[5-6]。现行标准中未对辅料蜂蜜质量进行控制，故拟建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定附子理中丸（大蜜丸）辅料蜂蜜中葡萄糖和果糖成分，以期为附子理中丸及同类药品的质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC20AT型 HPLC仪，RID-10A检测器（日本岛津公司）；LC350A型超声波处理器（济宁市鲁超仪器有限公司）；CP225D型十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）； Milli-Q Advantage A10型超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试剂与试药

果糖对照品（批号：100231-201807），D-无水葡萄糖对照品（批号110833-201707，中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱纯），醋酸（色谱纯），磷酸（纯度85 %，默克公司）；其他试剂均为分析纯，水为纯化水（自制）。附子理中丸（大蜜丸）15批次，来自我省11个地市，产自全国各地不同企业。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相：乙腈-水（85:15），流速0.8 ml/min，以Prevail Carbohyrate ES为色谱柱，柱温25 ℃，示差折光检测器检测。理进样体积15 μl。理论板数：按果糖峰计应不低于2000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照溶液的制备 取果糖、D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加40 %乙腈，分别制成每1 ml含果糖15 mg、D-无水葡萄糖16 mg的溶液，摇匀，滤过，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品剪碎，取约2.0 g，精密称定；置具塞锥形瓶中，精密加入40 %乙腈50 ml，密塞，称定重量，超声处理20 min，放冷，用40 %乙腈补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按附子理中丸的处方比例和生产工艺制备缺炼蜜的阴性样品，并按2.2.1项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密量取2.2项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱（见图1）。由图1可见，供试品溶液主峰与对照品溶液主峰保留时间一致，阴性对照溶液无干扰，说明本方法专属性良好。

图1 HPLC图谱

2.3.2 线性关系考察 分别配制果糖、D-无水葡萄糖系列浓度混合对照品溶液，使其每1 ml分别含果糖5.0001，10.0002，15.0005，20.0073，25.0013 mg，D-无水葡萄糖5.3337，10.6669，16.0002，21.3341，26.6673 mg。精密吸取系列浓度混合对照品溶液各15 μl，按上述色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归。果糖回归方程为：Y=3.07523X+0.18501，相关系数r=0.9998，结果显示果糖在75.0015～375.0150 μg范围内线性关系良好。葡萄糖回归方程为：Y=3.2692X+0.1175，相关系数r=1.0000，结果显示葡萄糖在80.0015～400.0075 μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 精密吸取2.2.1项下同一对照品溶液15 μl，连续进样6次，按2.1项下色谱条件测定，结果果糖、葡萄糖峰面积RSD分别为0.5 %，0.9 %，说明本方法精密度较高。

2.3.4 稳定性试验 按2.2.2项下方法制备附子理中丸（2号企业，批号为180101）的供试品溶液，进样分析。于2，4，8，12，24 h后分别再次进样分析，记录并比较果糖、葡萄糖含量的变化，评价样品溶液中果糖、葡萄糖室温放置不同时间的稳定情况。结果6个检测点果糖、D-无水葡萄糖峰面积的RSD分别为0.3 %，0.1 %，表明果糖、葡萄糖在室温放置24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批号样品附子理中丸（2号企业，批号：180101）6份，按2.2项下方法制备对照品和供试品溶液，进样分析，记录并比较果糖、葡萄糖含量的变化。结果6份样品的果糖、D-无水葡萄糖的RSD为分别为0.6 %，0.5 %（均小于2 %），表明该方法重复性良好。

2.3.6 回收率试验 取已知含量的附子理中丸（2号企业，批号：180101）样品约1.5 g，精密称定，置50 ml具塞锥形瓶中，共9份，按样品含量的50 %，100 %，150 %，分别加入3个不同浓度果糖、D-无水葡萄糖的混合对照品溶液（每个浓度 3 份），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。结果平均回收率分别为100.03 %，99.34 %，RSD分别为1.33 %，1.42 %，表明该方法回收率良好，结果见表1。

2.4 样品测定

精密称取15批次附子理中丸 （大蜜丸）样品各2份，分别按2.2项方法制备对照品溶液和供试品溶液，分别按2.1项色谱条件测定果糖和葡萄糖的含量，以外标法计算样品含量，结果见表2。附子理中丸果糖与葡萄糖总量在23.9 %～50.8 %之间，果糖与葡萄糖比值分别在0.65～2.11之间。

3 讨论

蜂蜜是附子理中丸（大蜜丸）的主要辅料，具有润肠降压、保护肝脏、增强免疫力的效果[7]，主要成分有蛋白质、糖类、维生素、多酚类和矿物质等。作为一个复方药物，附子理中丸成分复杂，因此本研究对提取方式和指标成分均进行了优化选择。

3.1 指标成分的选择

2015年版《中国药典》一部规定，蜂蜜中果糖和葡萄糖的总含量不得低于60 %，果糖与葡萄糖含量比值不得小于1.0[1]。因此，糖类成分为蜂蜜质量考察的重要指标[8-9]。本研究根据上述标准及样品测定结果，结合制剂工艺等因素，拟定附子理中丸（大蜜丸）果糖、葡萄糖总量（%）不得少于31.4 %，比值不得小于1.0 %，与药典标准统一。

表1 加样回收率测定结果（n=9）

表2 样品测定结果

3.2 柱温考察

分别设置柱温20，25，30，35，40 ℃，测定供试品溶液，结果温度在30 ℃以上色谱峰的保留时间有严重漂移，考虑到环境温度等综合因素，最终确定试验温度为25 ℃。

综上所述，该方法科学、可靠，能在短时间内同时检测附子理中丸中果糖和葡萄糖含量，最大限度地排除其他化学成分的干扰，具有快速、灵敏和准确的优点，为该药辅料的质量控制提供了依据。