辣木叶高效高压差低温连续式提取工艺优化及过程控制指纹图谱研究

刘常青，段海霞，唐晓纯，宋力飞，刘乡乡

（广州泽力医药科技有限公司，广东 广州 510663）

辣木（Moringa oleiferaLam）是辣木科（Moringaceae）、辣木属（Moringa Adans）植物，又名鼓槌树，原产于热带、南亚热带的干旱或半干旱地区，目前在海南、福建、广东等南方地区均有栽培[1-2]。现代研究表明，辣木叶的化学成分主要有黄酮类、多糖类、生物碱类和蛋白质等[3]，在降血糖[4-5]、降脂[6]、抗氧化[7]、改善睡眠[8]等方面有显著效果。其中，黄酮类成分主要有异槲皮苷、没食子酸、山奈酚、绿原酸等[3]，且含8种人体生命活动所需的必需氨基酸[9]。

高效高压低温连续式提取（high performance high pressure and low temperature successive extraction，HHLSE）技术可在极短的时间内形成-0.1～35 Mpa高压差并形成高速流，使细胞完全破碎，可促进有效成分的快速溶解，大大提高目标成分的提取率。本研究采用HHLSE技术[10]制备辣木叶提取物，通过正交试验对HHLSE参数进行优化，同时采用指纹图谱对关键点的工艺过程进行质量评价，能更直接、更充分地监测工艺过程中目标成分的转移，为辣木叶相关产品的开发提供稳定可靠的技术保证。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效高压差连续式低温提取分离浓缩集成技术装备（广州泽力医药科技有限公司）；800B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Agilengt1100系列高效液相色谱仪（包括DAD 阵列检测器，美国Agilent 公司）；Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；DV215CD 型电子天平（美国奥豪斯公司）；KQ3200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW135 型中药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；FJ-200高速分散均质机（上海标本模型厂）；ZL-I-021手持糖度计（广州计量检测技术研究院）；R系列旋转蒸发仪（无锡星海生化设备有限公司）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 材料

辣木叶，产自云南西双版纳，2019年4月采摘；没食子酸（成都普思生物科技有限公司，纯度≥90.1 %，批号：P80380030）；异槲皮苷（北京仪化通标科技有限公司，纯度≥98 %，批号：170526-0373）；乙腈，甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 原药材前处理

取适量干燥的辣木叶药材，经万能粉碎机粉碎后过80目筛，保存于阴凉室中，待用。

2.2 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.05 %磷酸（B），梯度洗脱：0～20 min，5 %～10 % A；20～40 min，10 %～28 % A；40～65 min，28 %～50 %A；65～75 min，50 %～100 %A；检测波长为230 nm；柱温为35 ℃；进样量为10 μl；体积流量为1.0 ml/min。

2.3 供试品溶液制备

2.3.1 原药材供试品溶液制备 精密称取辣木叶粉末4 g，置于50 ml锥形瓶中，加入纯化水20 ml，超声处理30 min（功率500 W，频率53 kHz），补足减失的重量，过滤，摇匀后取滤液，0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 工艺过程样品处理 工艺过程中固体样品按2.3.1项下方法处理，即得；液体样品经真空干燥，1:5纯水复溶，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 没食子酸和异槲皮苷对照品溶液制备

精密称取没食子酸对照品和异槲皮苷对照品各适量，分别用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，摇匀，即得质量浓度为0.2523 mg/ml的没食子酸对照品溶液和0.2254 mg/ml的异槲皮苷对照品溶液。

2.5 指标性成分的指认

采用对照品对HPLC指纹图谱中的各峰进行归属，结果见图1。经过对辣木叶细碎品和对照品色谱图相对保留时间和紫外吸收光谱两项指标的比对，确定了异槲皮苷、没食子酸为辣木叶中的主要黄酮类活性成分，且含量较高，故将两者作为指标性成分。HPLC指纹图谱中，没食子酸的洗脱时间为8.653 min，异槲皮苷的洗脱时间为56.2 min。

2.6 不同提取工艺的对比研究

图1 辣木叶与对照品HPLC指纹图谱匹配图

2.6.1 热回流提取 参考相关文献[11]，准确称取适量辣木叶粉末，置入500 ml圆底烧瓶，加入200 ml纯化水，加热回流2 h后，冷却至室温，收集提取液，4000 r/min离心分离，将所得上清和沉淀物分别按2.3.2项下方法制备供试品溶液后，进行HPLC指纹图谱分析。

2.6.2 HHLSE 准确称取适量辣木叶细碎品，按一定的溶剂倍量加入适量纯化水，于常温下进行高效高压提取，提取液经4000 r/min分离，将所得上清和沉淀物分别按2.3.2项下方法制备供试品溶液后，进行HPLC指纹图谱分析。两种提取方式所得样品的HPLC指纹图谱见图2。

图2 2种提取工艺的HPLC指纹图谱对比

由图2可见，两种提取方式所得离心上清谱图信息差异较大：热回流所得离心上清谱图中的成分种类远少于HHLSE，两种指标性成分均被破坏；HHLSE所得离心上清谱图中的成分种类与辣木叶原料基本一致，且没食子酸和异槲皮苷两种成分能得到很大程度的保留。同时对比两种不同工艺的离心沉淀色谱图，两者峰型相似，成分种类及含量均远少于相对应的离心上清，说明仅有极少部分水溶性成分未被提取出，因此后续试验可直接舍弃离心沉淀。

2.7 辣木叶HHLSE提取工艺优化

2.7.1 辣木叶蛋白质提取率测定 参考相关文献[12]，采用凯氏定氮法测定辣木叶中蛋白质含量：准确称取2 g供试辣木叶粉，平行测定3份，计算平均值，同时吸取空白消化液作为空白。按不同条件提取辣木叶蛋白质后，4000 r/min离心15 min，上清采用凯氏定氮法测定蛋白质含量，按下式计算蛋白质提取率。

提取率（%）=提取液中蛋白含量/辣木叶干粉中粗蛋白含量×100

2.7.2 正交试验设计 本研究采用小型均质机模拟高压差提取器提取过程，简便有效地优化辣木叶提取条件，为后续HHLSE提供依据。选定提取溶剂类型、提取次数及溶剂倍量[即固液比（g/g），每克药材使用的提取溶剂总量]作为考察的3个因素，以蛋白质提取率为评价指标，采用L9（33）正交试验进行研究。详见表1、表2。

表1 正交试验设计

表2 正交试验结果

由表2可见，溶剂类型对辣木叶蛋白质的提取率影响最大，提取次数、溶剂倍量的影响无统计学意义。经直观比较并结合试验结果，辣木叶蛋白均质提取最优条件为：以纯化水为溶剂，溶剂倍量30，提取3次，蛋白质平均提取率27.9 %。

2.8 验证试验

根据生产实际并结合L9（33）正交试验结果，取药材量30倍的水，在-0.1～35 Mpa压差下HHLSE提取3批，蛋白质平均提取率为48.56 %，RSD为1.54 %，表明此工艺稳定可行。

2.9 辣木叶HHLSE提取浓缩过程指纹图谱分析

以没食子酸和异槲皮苷为指标性成分，采用HPLC指纹图谱对工艺关键点进行评价。按前期确定的工艺参数，选定辣木叶原材、离心、微滤、反渗透浓缩、喷雾干燥等关键工序，收集各工序样品，分别按2.3项下方法制备供试品溶液，进行HPLC指纹图谱分析比对，见图3、图4。

图3 辣木叶原材与提取样品HPLC指纹图谱对比

图4 辣木叶4个HHLSE工艺关键点样品HPLC指纹图谱对比

由图3与图4可见，药材中没食子酸和异槲皮苷这两种成分能高效转移至最终的喷雾干燥粉中，而离心沉淀、微滤浓液及反渗透浓缩清液中两种指标性成分含量极低，且谱图信息少，工艺过程可直接舍弃这3部分物料，也充分说明HHLSE组合提取工艺能保留辣木叶大部分有效成分，为辣木相关产品的开发提供可靠的提取工艺。

3 讨论

本研究结果表明HHLSE提取效果优于热回流提取；另结合均质提取正交试验法优化HHLSE提取工艺条件，最终确定HHLSE方式最佳工艺条件为：提取溶剂水，溶剂倍数为30倍，蛋白质提取率可达48.56 %；分析HHLSE提取、过滤浓缩过程中关键控制点的指纹图谱，表明HHLSE组合提取工艺适用于辣木叶有效成分的提取及保留，可为辣木相关产品的开发提供可靠的提取工艺。