苦参燥湿止痒洗剂质量标准研究

张乐青，亓淑芬*，李 培

（1. 阳谷县人民医院，山东 阳谷 252300；2. 聊城市食品药品检验检测中心，山东 聊城 252000）

苦参燥湿止痒洗剂是阳谷县人民医院根据临床实践总结的有效方剂，由苦参、黄柏、蛇床子、白鲜皮、荆芥、防风、透骨草、地肤子、花椒共九味中药组成；有清热燥湿、杀虫止痒功效；用于治疗带下病属湿热下注证，症见带下量多、色黄、气臭、外阴瘙痒等。为保证苦参燥湿止痒洗剂临床疗效和质量稳定，本研究制定了蛇床子、防风的薄层鉴别方法。苦参为该洗剂中的君药，有杀虫利尿，清热燥湿功效，主要活性成分为苦参碱，采用HPLC测定其含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 InfinityⅡ色谱工作站（美国安捷伦公司）；检测器（DEBAV00573）；KH3200DB型数控超声波清洗器（昆山禾创）；ZW-3型多功能紫外分析仪（济南三泉中石）；BSA224S-CW电子天平（北京赛多利斯）；硅胶板（青岛海洋化工厂分厂）。

1.2 试药与试剂

苦参碱对照品（批号110805-201709），蛇床子素对照品（批号101236-201509），防风对照药材（批号120947-201409），均由中国食品药品检定研究院提供。苦参燥湿止痒洗剂由阳谷县人民医院提供（批号：20190822，20190825，20190828）；蛇床子阴性溶液、防风阴性溶液、苦参阴性溶液均为处方除去相应药味后，按处方比例及制备工艺同法制得；乙腈（瑞典欧普森）为色谱纯，水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 蛇床子素 取30 ml苦参燥湿止痒洗剂，先后两次分别加30 ml乙醚萃取，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加1 ml乙醇使溶解，作为供试品溶液。取30 ml蛇床子阴性溶液，按照供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。另取蛇床子素对照品，加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，分别吸取上述3种溶液各8 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯（15:1）为展开剂，展开，取出薄层板，晾干，置紫外灯（365 nm波长）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液相应的位置上，出现相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，结果见图1。

图1 蛇床子薄层色谱鉴别

2.1.2 防风 取20 ml苦参燥湿止痒洗剂，使用二氯甲烷液萃取两次，每次20 ml，弃去二氯甲烷液，水液用正丁醇提取2次，每次20 ml，合并两次正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。取20 ml防风阴性溶液，按上述方法制备阴性对照溶液。再称取0.5 g防风对照药材，加20 ml丙酮，超声30 min，过滤，蒸干，残渣加1 ml甲醇使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502），分别吸取上述3种溶液各5 μl，点在同一硅胶G薄层板上，用二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（10:3:1）为展开剂，展开，取出薄层板，晾干，置紫外灯（254 nm波长）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应的位置上，出现相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。结果见图2。

图2 防风薄层色谱鉴别

2.2 苦参碱的含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Ultimate XB-NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相[1-3]：无水乙醇-乙腈-3 %磷酸溶液（10:80:10），检测波长：220 nm，柱温：30 ℃，流速：1.0 ml/min，进样量：10 μl。理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于2000。

图3 高效液相色谱图

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取苦参碱对照品12.66 mg，置入25 ml量瓶，加无水乙醇-乙腈（20:80）混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，做为对照品贮备液。再精密量取对照品贮备液1 ml至10 ml量瓶，加无水乙醇-乙腈（20:80）混合溶液稀释至刻度，摇匀，即得[4]。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取苦参燥湿止痒洗剂20 ml，置分液漏斗中，加浓氨溶液1 ml混匀，加三氯甲烷萃取，共萃取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，残渣加三氯甲烷适量使溶解，并转移至25 ml量瓶，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液10 ml，加入中性氧化铝柱（5 g，内径1 cm），依次用20 ml三氯甲烷和20 ml三氯甲烷-甲醇（1:1）溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加无水乙醇适量使溶解，并转移至10 ml量瓶，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 精密量取苦参阴性溶液20 ml，按2.2.3项下方法制成阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μl，按2.2.1项下色谱条件进行测定并且记录色谱图，见图3。供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱图的相应位置，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间处无干扰。

2.2.6 线性关系考察 精密量取对照品贮备液0.2，0.5，1，2，4 ml，分别置入10 ml量瓶，加无水乙醇-乙腈（20:80）混合溶液稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 μl，按2.2.1项下的色谱条件进样测定。以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标进行线性回归，得线性回归方程为Y=60.038C-97.8，r=0.9998（n=5）。结果表明，苦参碱在浓度为10.128～202.56 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 重复性试验 取同一批（批号：20190822）样品5份，按2.2.3项下的方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，测得苦参碱的平均含量为0.123 mg/ml，RSD为0.3 %（n=5），表明方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取线性关系考察项下质量浓度为50.64 μg/ml的苦参碱对照品溶液，分别在配制后0，2，4，8，10，12 h进样测定，结果苦参碱峰面积的RSD为0.9 %（n=6）。结果表明，对照品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.9 精密度试验 取2.2.6项下的对照品溶液（浓度为50.64 μg/ ml），连续进样测定5次，结果苦参碱峰面积的RSD为0.4 %（n=5），结果表明仪器精密度良好。

2.2.10 加样回收率试验 分别精密量取已知苦参碱含量的样品溶液（批号：20190822）10，20，30 ml各2份，置于分液漏斗中，再分别加入浓氨溶液0.5，1，1.5 ml，混匀，用20 ml三氯甲烷萃取3次，合并萃取液，蒸干，残渣加三氯甲烷适量使溶解，并转移至25 ml量瓶，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀。分别精密量取各溶液10 ml，加入中性氧化铝柱（5 g，内径1 cm），再精密量取苦参碱对照品贮备液1 ml共3份、2 ml共3份，分别加入中性氧化铝柱（5 g，内径1 cm）中，依次用20 ml三氯甲烷和20 ml三氯甲烷-甲醇（1:1）溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加无水乙醇适量使溶解，并转移至10 ml量瓶，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。按2.2.1项下色谱条件进行测定，测得苦参碱的平均回收率为99.7 %，RSD为1.1 %（n=6），见表1。

表1 加样回收率试验（n=6）

2.2.11 样品含量测定 取3种不同批号的样品溶液（批号为20190822，20190825，20190828），按2.2.3项方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，按外标法计算各供试品中苦参碱的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

参考《中国药典》及相关文献，对苦参燥湿止痒洗剂中防风进行TLC鉴别，分别采用三氯甲烷-甲醇（3:1）[5]、氯仿-无水乙醇-乙酸乙酯（42:1）[6]、三氯甲烷-甲醇（4:1）[7]及二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇（10:3:1）做展开剂，结果以二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇（10:3:1）为展开剂时，各斑点间的分离度比较好，阴性溶液无干扰，且主斑点更加清晰。在对蛇床子进行TLC鉴别研究中，分别采用甲苯-乙酸乙酯（9:1）[8]、苯-乙酸乙酯（30:1）[9]、苯-乙酸乙酯（15:1）为展开剂，结果以苯-乙酸乙酯（15:1）为展开剂时，薄层板显色后主斑点更清晰；且只有在该展开剂条件下，各斑点分离清晰。因苦参碱的含量可采用HPLC法进行较为精确的测定，故不再做苦参的薄层鉴别。

在苦参碱含量测定供试品的制备研究发现，实验过程中取样品40 ml制成供试品溶液，取10 μl注入液相色谱仪测定，消耗三氯甲烷和浓氨试液均较多，结果RSD大于2.0 %；取样品10 ml制成供试品溶液，取10 μl注入液相测定，结果峰形不理想，最终确定取样量为20 ml，得浓度为120 μg/ml的供试品溶液时，得到的色谱图最理想。苦参中的活性成分主要为苦参碱和氧化苦参碱，氧化苦参碱在加热提取的过程中逐渐被还原成苦参碱[10]，而苦参燥湿止痒洗剂是经过加热提取的，氧化苦参碱未检出，所以本实验采用HPLC只检测苦参中的苦参碱含量。本方法简便、准确，重现性好，结果稳定，可为控制苦参燥湿止痒洗剂的质量，保证其临床用药的有效性提供参考。