双波长分光光度法快速测定母乳替代品中钙磷比

（陕西学前师范学院 化学化工学院，陕西 西安 7100100）

当母乳不能提供足够营养时，需及时采用母乳替代品为婴幼儿提供营养物质。为确保母乳替代品中钙磷比例适合婴幼儿吸收[1]，生产厂家和质监部门需对母乳替代品中的钙、磷含量进行测定。现行的做法是采取不同分析方法分别测量钙、磷含量，需用到不同仪器，过程繁琐、费时，测量效率较低、人力成本较高。已有可同时测定钙、磷含量的方法是电感耦合等离子体发射光谱法[2-3]，但该类仪器价格昂贵，操作要求高[4]，不适合常规检测。本文采用紫外可见分光光度法，通过控制钙、磷测量条件，实现用同一方法不经分离同时测量样品中钙磷含量，并用加标回收率检验[5]，结果满意。该法准确度高，操作方便快捷，测量成本低。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-8000S 紫外可见分光光度计（上海元析）；PHS-3C精密pH计（上海仪电）。

1.2 材料

样品1（贝因美菁爱婴儿配方奶粉0～6月龄，1段，贝因美婴童食品股份有限公司，20190716）；样品2（贝因美菁爱幼儿配方奶粉12～36月龄，3段，贝因美婴童食品股份有限公司，20190915）；样品3（亨氏超金健儿优婴儿营养米粉，亨氏联合有限公司，20190730）。磷酸二氢钾（天津科密欧）；碳酸钙（上海山浦化工）；钼酸铵（天津科密欧）；对苯二酚（天津科密欧）；亚硫酸钠（西安天正康源）；钙羧酸指示剂（天津科密欧）；三乙醇胺（天津科密欧）；乙醇（三明三圆）；醋酸，醋酸钠（天津天力）；所用试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 吸收图谱及标准曲线绘制

取一组50 ml量瓶，标为1号、2号，同时加入20 μg/ml钙标准溶液3 ml、50 μg/ml磷标准溶液1 ml，加入pH 5.4醋酸-醋酸钠缓冲溶液10 ml，加入磷显色系列溶液（50 mg/ml钼酸铵溶液1 ml、200 mg/ml亚硫酸钠溶液0.5 ml、5 mg/ml对苯二酚溶液0.5 ml），常温下反应30 min；2号量瓶加入钙羧酸显色剂5 ml，一并定容至50 ml，再反应10 min，以空白溶液作参比，扫描钙、磷显色液吸收曲线并测定吸光度。平行测定5次，以吸光度为纵坐标（y），磷或钙的浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。

2.2 最佳实验条件的筛选

研究指示剂/显色剂加入顺序、pH值、反应时间、温度等对钙磷同时测定的影响。

2.2.1 指示剂/显色剂加入顺序对吸光度的影响影响室温下，取3只50 ml量瓶，标为a、b、c号，加入1 ml磷标准液，3 ml钙标准液。a号同时加入钙、磷显色剂溶液，定容，反应40 min后测定；b号先加入磷显色剂溶液，反应30 min后，加入钙显色剂溶液，定容，等待10 min，测定；c号先加入钙显色剂溶液反应10 min后，加入磷的指示剂溶液，定容，反应30 min后测定。

2.2.2 pH值对吸光度的影响 室温下，取5只50 ml量瓶，加入钙、磷标准液，先加入磷显色剂溶液，又加入钙显色剂溶液，调节溶液pH分别为2.0，4.0，5.4，6.0，7.0，反应后测量。

2.2.3 反应时间对吸光度的影响 室温下，于50 ml量瓶中加入钙、磷标准液，加入pH 5.4醋酸-醋酸钠缓冲溶液10 ml，加入磷显色剂溶液，反应30 min后，加入钙显色剂溶液，定容，分别于反应5，10，25，35，60，90，120 min测量。

2.2.4 温度对吸光度的影响 选取15～30 ℃为研究区间，每隔5 ℃选取一个检测点。于50 ml量瓶中加入磷标准液1 ml，钙标准液3 ml，10 ml pH 5.4醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在检测温度下，加入钙磷显色剂溶液，按要求反应后进行测量。

2.3 样品测定

利用湿法消解[6-9]：取样品0.6 g，置入锥形烧瓶，加入10 ml 硝酸:高氯酸（4:1）混合溶液，电热炉上消解，待液体余2～3 ml时将样品取下，冷却。再加入10 ml混合酸，继续加热，若变黑则加入5 ml硝酸继续消化，当溶液变为无色或淡黄色后，消化完成[10-12]，转入100 ml量瓶中定容，得消化稀释样品。

取两份2 ml消化后的样品，分别置入50 ml量瓶，标为1号和2号。按2.1项所述方法操作，待反应完成后测定。读取710 nm处吸光度，利用标准曲线计算样品中磷含量；读取2号量瓶556 nm处总吸光度及1号量瓶磷在该波长处的吸光度，做差得钙在556 nm处的吸光度，利用标准曲线计算样品中钙含量。每种样品平行测3组，计算消化稀释样品中钙磷含量，换算为每100 g母乳替代品中钙、磷量。

3 结果与分析

3.1 钙、磷显色吸收曲线比较

见图1～3。磷在710 nm处产生强而稳定的吸收带（图1），在该波长处钙不产生吸收，故其吸光度可直接用于磷含量测定；钙在556 nm处有最大吸收（图2），吸光度随波长急剧下降，在该波长处磷有弱吸收（图3），故通过检测556 nm处总吸光度并扣除磷的吸收，即可实现对钙的测定，据此实现对同一样品中钙、磷的快速连续测定。

图1 磷显色吸收曲线

图2 钙显色吸收曲线

图3 磷、钙同时测定显色吸收曲线

3.2 最佳实验条件筛选

3.2.1 显色剂加入顺序对吸光度的影响 显色剂加入顺序对钙的吸光度影响较小，对磷的吸光度影响较大（见图4），实验中先加入磷系列显色溶液使其充分反应后加入钙显色剂时，测量钙、磷的吸光度均获得理想值。

3.2.2 pH值对吸光度的影响 pH 5.4时钙的吸光度最高，磷的吸光度受pH影响较小（见图5），故通过加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液控制体系pH值为5.4。

3.2.3 反应时间对吸光度的影响 磷和显色剂反应30 min吸光度趋于稳定，并在钙与显色剂反应10 min后，钙磷吸光度均达峰值（见图6）。

3.2.4 温度对吸光度的影响 15～35 ℃区间温度变化对磷的吸光度影响有限，钙的吸光度在25 ℃时达最高（见图7），实验选择在室温25 ℃测定。

图4 试剂加入顺序对吸光度影响

图5 pH值对吸光度的影响

图6 反应时间对吸光度的影响

图7 温度对吸光度的影响

3.3 磷与钙的标准曲线的测定

按2.2项方法绘制磷和钙的标准曲线，磷的标准曲线：y=0.01x-0.0257，R2=0.9990；钙的标准曲线：y=0.001x+0.0497 ，R2=0.9998。结果表明，磷和钙的浓度分别在0.3～1.7，0.4～2 μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。

4 样品分析结果

4.1 磷与钙的测定值

结果见表1～2。

表1 母乳替代品中磷含量测定结果（n=3）

表2 母乳替代品中钙含量测定结果（n=3）

4.2 加标回收实验

取2 ml样品消化稀释液，置入50 ml量瓶，加入15 μg/ml磷标准溶液1 ml，显色后测定吸光度，计算磷含量和回收率，结果磷回收率为96.7 %～112.3 %；按同样方法，于样品中加入20 μg钙，进行钙加标回收实验，结果钙回收率为97.2 %～ 108.4 %。结果表明该法准确可靠。

5 结论

本研究利用双波长分光光度法，建立一种不经分离即可对样品中钙、磷含量同时测定的新方法。结果表明，该法准确、便捷，所用仪器简单。利用此法可实现对母乳替代品中钙磷比进行快速检测，给乳制品生产厂家和质监部门提供新的选择。

用该法对市面上常见母乳替代品进行测量，结果表明，样品3钙磷比为1.6:1，最接近母乳中钙磷含量（2:1）。样品1和2的钙磷比分别为1.5:1和1.4:1，钙比例较低，建议在没有母乳的情况下，科学增加婴幼儿钙的摄入。