HPLC测定处方中大黄素和大黄酚的含量*

洪开文，宋 伦，郑 重,陈 懿，卢海莎

(1 安顺职业技术学院应用医药系，贵州 安顺 561000；2 黔中民族药(苗药)资源开发与产业化协同创新中心，贵州 安顺 561000)

黔中屯堡地区多年来使用含有中大黄、眼子菜、刺梨根、龙牙草等4味药材组成酒剂处方，经过实践证明，该处方具有清热通便、止血等功效，在黔中屯堡地区用于酒泡服后治疗便秘、痔疮等疗效显著。方中大黄为主要药材之一，具有明显泻下作用。研究表明，以大黄素、大黄酚等为代表的游离蒽醌类化合物是大黄的主要有效成分[1]。本研究通过HPLC法测定处方中大黄素和大黄酚含量，作为内在质量控制指标之一。

1 仪器与试剂

1.1 仪 器

LC-20AT高效液相色谱仪，日本津岛；Elmasonic Easy30H超声清洗机；PTX-FA110S电子天平；艾柯exceed-c实验室专用超纯水机。

1.2 试 剂

大黄素对照品(批号 110756-200111，供含量测定用)、大黄酚对照品(批号110796-201318，供含量测定用)，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，提取用的甲醇、二氯甲烷等为分析纯，水为实验室自制超纯水。

2 实验方法

2.1 色谱条件[2]

固定相：依立特C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15，V/V)；检测波长为240 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3500。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取干燥的大黄素对照品、大黄酚对照品适量，加甲醇溶液溶解，分别制成每1 mL含大黄素10.16 μg、大黄酚28.38 μg的混合溶液。

2.2.2 样品溶液的制备[3-6]

取处方当量药材粉末(过四号筛)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流45 min，放冷，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理(功率250 W，频率40 Hz)5 min，再加二氯甲烷10 mL，加热回流1 h，冷却，移至分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取二氯甲烷液，酸液用二氯甲烷振摇提取2次，每次15 mL，合并二氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶液使溶解，转移至25 mL量瓶中，加甲醇溶液至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔膜滤过，取续滤液作为样品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备

取缺大黄阴性混合粉末样品，按2.2.2项下样品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

3 空白实验

图1阴性样品溶液

图2样品溶液

图3对照品溶液

分别吸取“2.2”项下的混合对照品溶液、空白试剂、样品溶液及阴性样品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定。结果：阴性样品溶液中不含大黄酚、大黄素的峰。见图1、图2、图3。

4 方法学考察

4.1 线性关系考察

精密称取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，加甲醇溶液溶解分别制成每1 mL含大黄素、大黄酚各10.16 μg、28.38 μg的混合溶液，精密吸取0、5、10、15、20、25 μL依次注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，大黄素线性回归方程为Y=99335X+458.5，r=0.9996，大黄酚线性回归方程为Y=39468X+1380，r=0.9998。结果表明，大黄素进样量在0.0508～0.2540 μg线性范围内与峰面积呈线性关系，大黄酚进样量在0.1419～0.7095 μg线性范围内与峰面积呈线性关系。

4.2 重复性实验

取同一批次样品，按“2.2”项下样品的制备方法，平行制备6份样品溶液，进样10 μL进行测定，分别计算大黄素和大黄酚的RSD值。结果：大黄素和大黄酚的RSD值分别为1.26%、1.32%，即大黄素、大黄酚重复性好。

4.3 稳定性实验

取同一批次样品溶液，分别于0、0.5、1、2、3、4 h下进行进样10 μL，按上述色谱条件测定大黄素、大黄酚的峰面积，并计算其RSD值。结果：大黄素和大黄酚的RSD值分别为2.1%、1.8%，即稳定性好。

4.4 精密度实验

在上述色谱条件下，取按“2.2”项下配制的大黄素、大黄酚混合溶液分别连续进样5次，每次取10 μL，分别计算大黄素和大黄酚峰面积的RSD值。结果：大黄素和大黄酚的RSD值分别为0.36%、0.65%，即精密度好。

4.5 回收率实验

取同批次样品6份，精密称取1 g，分别精密加入大黄素对照品(6.1900 mg)和大黄酚对照品(9.7200 mg)，按“2.2”项下操作制备样品溶液并测定，计算回收率和RSD值。结果：大黄素的平均回收率为98.71%(RSD=1.37%)，大黄酚的平均回收率为98.52%(RSD=1.31%)，见表1、表2。

表1 大黄素回收率实验结果

表2 大黄酚回收率实验结果

4.6 样品测定

取样品溶液10 μL，连续进样3次，依法测定记录各组分的峰面积值取平均值，分别计算，结果：大黄素含量为12.1856 mg/g、大黄酚含量为19.5257 mg/g。

5 结 论

按上述色谱条件，通过空白试验，对阴性样品溶液的测定在其峰的相应的位置上无干扰峰出现，说明处方中其他成分对测定结果无干扰，该提取方法简单、具有专属性，可以为该处方的质量标准研究提供依据。

本研究用二氯甲烷提取药材，相比药典的三氯甲烷提取，毒性更低，价格便宜，回流温度低，且所测含量相差不大，实验表明用二氯甲烷提取药材是可行的。