基于网络药理学鸡血藤治疗肝细胞癌的作用机制研究▲

廖健明 秦祖杰 杨秋雨 黎仁权 许围城

(1 广西中医药大学研究生学院，南宁市 530000，电子邮箱:1634935973@qq.com；2 广西中医药大学附属国际壮医医院，南宁市 530200)

肝细胞癌是原发性肝癌中最常见的类型，其发病率及死亡率高，严重威胁我国人民健康[1]。大多数肝细胞癌患者确诊时已处于疾病晚期或已发生转移，因此手术切除、血管介入、射频消融术及肝移植等治疗未能达到根除治疗的目的；同时传统化疗治疗肝细胞癌效果差，而分子靶向药物的治疗范围也较局限[2]，因此效果也相当有限。

壮医药具有明显的地区特色及民族特色，对于治疗壮族聚居地区常见病、多发病具有独到见解[3]。广西为我国药材资源极其丰富的地区，其中许多药物在预防和治疗肿瘤方面具有一定疗效[4]。肝癌，壮医未有明确病名，按照其临床表现，可纳入为黄标(黄疸)及水蛊(蛊病)范畴，认为其乃因正气虚弱，不能抗邪，导致毒邪内侵，使三气不能同步、三道两路不通而为病，其中多以龙路不通为主要表现，故易出现瘀血内患。壮药鸡血藤为豆科植物蜜花豆的干燥藤茎，性苦、甘，归肝、肾经，壮医认为其具有补血活血、通调龙路火路的功效[5]，可使瘀堵之龙路通畅，从而达到治疗肝癌的目的。鸡血藤中含有许多成分，现代研究表明，鸡血藤中的化合物主要有甾醇类、黄酮类、蒽醌类、萜类、苷类、内酯类等，具有抗肿瘤、抗氧化、调节血液系统、抗病毒、保肝等作用[6]。研究显示，补益气血及理气活血药在治疗肝细胞癌中具有极其重要的作用[7]，而鸡血藤具有活血补血之功，为临床上治疗肝癌的常用药，但其具体作用机制不明，同时鸡血藤含有较多化合物，因此研究鸡血藤作用机制具有一定的难度。

网络药理学通过分析疾病网络库、药物网络库、基因网络库、蛋白网络库等数据库中的信息，利用电脑软件及算法揭示疾病-药物-靶点-基因之间的关联，分析复杂药物作用于人体的机制[8]。故本研究通过网络药理学方法，分析鸡血藤的有效成分、作用靶标以及肝细胞癌的疾病相关靶标，构建中药-成分-疾病-靶标图形，并对筛选出的靶标进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，从而探讨鸡血藤治疗肝细胞癌的作用机制。

1 资料与方法

1.1 鸡血藤有效成分筛选及靶标预测 通过中药系统药理学数据库与分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php，版本2.3)，按照口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%、类药性(drug-likeness,DL)>0.18，初步筛选鸡血藤的有效成分。然后采用Perl软件(https://www.perl.org/get.html，版本10.0.0)对筛选出的相关有效成分的作用靶标进行预测。

1.2 添加鸡血藤作用靶标的基因名 利用Perl软件和UniProt知识库(https://www.uniprot.org)为筛选出的靶标添加基因名(gene symbol)，并将UniProt知识库中找不到相关基因名的靶标删除。

1.3 获取肝细胞癌相关疾病靶标 在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/，版本4.12)、OMIM数据库中(https://www.omim.org)，以“hepatocellular carcinoma”为关键词检索相关靶标，得到肝细胞癌的疾病相关靶标。

1.4 构建中药-疾病靶标 利用R语言软件(https://www.r-project.org/，版本3.6.1)，对鸡血藤作用靶标与肝细胞癌的疾病相关靶标取交集，得到中药-疾病共同靶标，并绘制Venn图。

1.5 构建中药-成分-疾病-靶标调控网络 利用Perl软件将1.2获得的靶标基因名与1.4获得的中药-疾病共同靶标进行映射，然后利用Cytoscape软件(https://cytoscape.org/，版本3.6.1)进行可视化分析，得到中药-成分-疾病-靶标调控网络。

1.6 中药-疾病靶标蛋白相互作用网络的构建与核心基因的筛选 在STRING在线软件(https://string-db.org/，版本11.0)中输入中药-疾病共同靶标，并以选择人为种属、0.4为最小互作分数作为筛选条件软件，得到并保存制作蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络所需的文件，再将所得文件利用R语言进行计算，最终得到PPI及其核心基因条形图。

1.7 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 将中药-疾病共同靶标输入R语言软件并计算，并以P<0.05为统计学差异，得到GO功能富集分析图和KEGG通路富集分析图。

2 结 果

2.1 鸡血藤的有效成分及其靶标 根据OB及DL对所有已报告的鸡血藤有效成分及相关靶标进行筛选，共搜索到有效成分24个(见表1)，相关靶标1 142个。

表1 鸡血藤的有效成分筛选结果

2.2 中药-疾病的共同靶标构建结果 将筛选出的1 142个鸡血藤作用靶标与6 713个肝细胞癌疾病靶标输入R语言软件并取交集，得到中药-疾病共同靶标的Venn图(见图1)，同时得到46个中药-疾病的共同靶标。

图1 中药-疾病靶标Venn图

2.3 中药-成分-疾病-靶标调控网络的构建结果 中药-成分-疾病-靶标调控网络见图2，提示壮药鸡血藤主要通过22种有效成分作用于46个共同靶标。

图2 中药-成分-疾病-靶标调控网络

2.4 PPI网络及核心靶标 相邻接的节点数目越多，作为核心基因的可能性越大，因此鸡血藤-肝细胞癌靶标PPI网络的核心基因按邻接节点数目由多到少排序依次为：表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、MYC、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific protease,Caspase)3、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、酪氨酸激酶受体2(receptor tyrosine kinase 2,ERBB2)、雌激素受体(estrogen receptor,ESR)1、鼠双微粒体2(murine double minute 2,MDM2)、Caspase8、骨髓细胞因子1(myeloid cell leukemia 1,MCL1)、RELA、雄激素受体(androgen receptor,AR)、Caspase9、细胞周期蛋白B1(cyclinB1)、过氧化物酶体增生激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)、细胞周期检控点激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1,CHEK1)、视网膜母细胞瘤1(retinoblastoma 1,RB1)、糖原合酶激酶3Β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3B)、含杆状病毒IAP重复序列蛋白5(baculoviral IAP repeat-containing protein 5,BIRC5)、Caspase7、淀粉样β前体蛋白(amyloid beta precursor protein,APP)、核因子κB抑制因子α(nuclear factor kappaB inhibitor alpha,NFKBIA)、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)、ESR2、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、蛋白激酶Cα(protein kinase C alpha,PRKCA)、核受体辅助活化子1(nuclear receptor coactivator 1,NCOA1)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,PLAU)、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,BCL2)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、谷胱甘肽S-转移酶Pi1(glutathione S-transferase Pi 1,GSTP1)、溶质载体家族2成员4(solute carrier family 2 member 4,SLC2A4)、肿瘤蛋白p63(tumor protein p63,TP63)、对氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1)、醛缩酮还原酶家族1成员B1(aldo-keto reductase family 1 member B1,AKR1B1)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ACHE)、NUF2。见图3～4。

图3 中药-疾病共同靶标的PPI网络

图4 中药-疾病核心靶标条图

2.5 GO功能富集分析结果 核心基因的GO功能主要有半胱氨酸型内肽酶活性参与的凋亡过程、类固醇激素受体活性、泛素样蛋白连接酶结合、核受体活性、转录因子活性、直接的配体调节序列特异性DNA结合、泛素蛋白连接酶结合、核激素受体结合等。见图5。

图5 GO功能富集分析柱状图

2.6 KEGG通路富集分析结果 癌核心基因的主要涉及通路：前列腺癌信息通路、人巨细胞病毒感染信号通路、乙型病毒性肝炎信号通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、EB病毒感染信号通路、膀胱癌信号通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物及其受体信号通路、p53信号通路、铂耐药信号通路、乳腺癌信号通路、癌症中的微小RNA信号通路、丙型病毒性肝炎信号通路、甲状腺激素信号通路等。见图6。

图6 KEGG通路富集分析柱状图

3 讨 论

壮医称肝脏为“咪叠”，认为其是血液贮藏的主要器官，具有调节血液流量的功能[9]。血液运行的道路为“龙路”，故肝为龙路聚集之地。酒食不节、毒邪外侵、情志内伤等多种因素导致机体损伤，龙路不通，而致肝脏损害，因龙路不畅而导致水湿气血积于腹内，易引起腹部胀大、腹水[10]，故壮医多将肝细胞癌列入“水蛊”的范畴。同时，壮医认为疾病的发生是因为人体气血分布的不均衡，临床上可出现气血偏衰、气血偏亢及气血瘀滞，在治疗时便使用调气、解毒、补虚、祛瘀四个原则来达到调整人体气血的目的[11]，从而使疾病恢复。“水蛊”在发病过程中，兼有气血偏衰及气血瘀滞两者，故在治疗时应使用补血通龙路的药物，而鸡血藤为常用的补血通龙路的药物。

本研究结果显示，鸡血藤主要通过22种有效成分作用于46个靶标，影响肝细胞癌相关的基因、酶及因子，达到治疗肝细胞癌的目的。进一步分析发现，鸡血藤-肝细胞癌靶标PPI网络的核心基因有EGFR、MYC、Caspase3、cyclinD1、IL-6、VEGFA、ERBB2、ESR1、MDM2、Caspase8等，而这些基因可影响胰岛素样生长因子-1受体活性、抗凋亡转录因子活性、磷脂酰肌醇3激酶活性、蛋白激酶B活性、黏着斑激酶活性、酪氨酸激酶2活性、cAMP反应元件结合蛋白/激活转录因子-2/激活蛋白-2活性、端粒酶活性、细胞因子B1活性、周期蛋白依赖性激酶1活性、丝裂酶原激活蛋白激酶活性、转化生长因子β活性[12-14]，因此推测鸡血藤通过调控以上基因，影响相关因子及酶的活性，从而达到治疗肝细胞癌的目的。

鸡血藤治疗肝细胞癌的核心基因涉及的KEGG通路众多，这些通路主要包括前列腺癌信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、乙型病毒性肝炎信号通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、EB病毒感染信号通路、膀胱癌信号通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物及其受体信号通路、p53信号通路、铂耐药信号通路、乳腺癌信号通路、癌症中的微小RNA信号通路、丙型病毒性肝炎信号通路、甲状腺激素信号通路等。其中乙型病毒性肝炎在肝细胞癌的发病过程中具有极其重要的作用；有研究表明，乙型肝炎病毒在肝细胞癌的转化过程中起到直接作用，乙肝病毒基因组可整合到宿主DNA中，且乙肝病毒X蛋白可影响宿主信号传导通路的调控和核转录因子的启动子水平，同时还可影响宿主T细胞免疫应答、内质网应激、免疫逃逸等作用[15]。此外，丙型病毒性肝炎起病隐匿，慢性感染者中有极高比例可发展为肝细胞癌，可能由丙肝病毒引起的氧化应激所致[16]；2型糖尿病是肝细胞癌的独立危险因素，胰岛素抵抗及2型糖尿病可引发胰岛素抵抗、脂肪代谢紊乱、炎症因子异常等，导致正常肝细胞凋亡，增加肝纤维化风险，从而导致肝细胞癌的发生[17]；人巨细胞病毒感染为人类感染率极高的一类病毒，可对婴幼儿肝脏造成损伤，先天性感染者尤甚[18]；卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒的传播途径与多种肿瘤的发病相关，其中包括肝细胞癌，这可能与该病毒与经血液传播的肝炎病毒的传染途径相似，影响乙肝病毒的复制相关，同时该病毒与鼻咽癌、原发性渗出性淋巴瘤等相关[19-20]；EB病毒为多种疾病的致病因素，如EB病毒性肝炎、鼻咽癌、伯基特淋巴瘤等，EB病毒性肝炎可导致严重的肝功能损害，而存在肝脏功能损害时又可诱导EB病毒从潜伏状态变成激活状态，从而加重肝功能损害[21]。

综上所述，鸡血藤治疗肝细胞癌的作用机制为鸡血藤中众多有效成分调控肝细胞癌的相关基因，从而影响多种信号通路，最终在多种信号通路的综合作用下，人体表现出相应的表型。需要注意的是，此表型除了受到中药影响外，还可受体内环境、体外环境及基础疾病的影响，因此在使用药物治疗时，应重视体内环境、体外环境及基础疾病的情况，注意因人而异、因时而异、因病而异，按照传统医学辨证辨病思维用药，达到使药物作用最大化的目的。