乙型肝炎病毒大蛋白检测在慢性乙型肝炎诊疗中的临床意义*

胡海石 董 博 王德景 苏亚娟 杜文功

1.廊坊市人民医院检验科 （河北 廊坊，065000） 2.廊坊市开发区人民医院检验科 3.廊坊市中心血站检验科

慢性乙型肝炎（CHB）的发病人群较广，流行病学研究证实，CHB的发病率可达483～686／1万人［1］。特别是在部分流行区，CHB的发病率可进一步上升［2］。在CHB的病情检测指标方面，部分研究者认为乙型肝炎病毒大蛋白（HBV LP）的表达能够评估患者的感染程度，HBV LP能够通过激活上游基因的转录速度，提高启动子的转录活性，进而影响到HBV DNA的扩增过程［3］。同时相关基础方面的研究还认为，HBV LP的上升能够提高HBV突变的风险，导致病毒耐药或者临床治疗结局的恶化［4］。部分研究者报道了HBV LP的表达及其与CHB患者治疗结局的关系，认为HBV LP在评估HBV感染或者预后的过程中能够发挥一定的作用［5］，但缺乏HBV LP与HBV DNA的对照分析。本研究探讨了HBV LP的表达及其与HBV DNA的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年1月在廊坊市人民医院治疗的CHB患者89例，其中男59例，女30例；年龄36～67岁，平均（51.20±8.19）岁；病程9个月～16年，平均病程（8.39±2.01）年。纳入标准：①符合中华医学会制定的CHB诊断标准的患者［6］；②未合并其他肝炎病毒感染者；③初治患者；④患者及家属知情同意。排除标准：合并有恶性肿瘤者；有肝脏手术史者。

1.2 治疗方法 患者口服恩替卡韦（国药准字H20052237，正大药业有限公司），0.5 mg，1次／d，连续3个月。治疗过程中，对于丙氨酸氨基转移酶（ALT）或者天门冬氨酸氨基转移酶（AST）大于40 U／L的患者给予肝苏颗粒或者飞利肝片保肝治疗。

1.3 检测方法 HBV DNA定量检测：采集患者的血清5 ml，加入0.2m l的氯仿，2～8℃离心（12 000 g／min，15min），反复洗涤RNA，弃上清液，在管底部可见一乳白色小沉淀物，加入1 ml 75% 乙醇，0.1% DEPC水溶解。加入HBV基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其终浓度均为20 pmol／μl，制备反应体系。RT-PCR 扩增条件与参数：48℃，45 min，94℃，2 min；94℃30 s，58℃60 s，68℃2 min，共40个循环；循环完毕后68℃延伸7 min。采集患者的静脉血3 ml，加入HBV LP单抗，标本和标准品中的HBV LP会与单抗结合，PBS液体洗涤5 min。按照1∶500的比例加入羊标志的一抗5 m l，4℃放置过夜，PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min，加入鼠来源的二抗（1∶1 000）2 ml，室温放置2 h，PBS液体洗涤5 min。加入显色底物，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450 nm处测OD值。

1.4 判断标准 HBV DNA阳性标准：病毒载量≥103拷贝／ml为阳性。HBV LP阳性标准：吸光度值≥0.105时为阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0进行统计分析，计量资料采用±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较使用χ2检验；相关性采用Pearson相关分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB患者HBV LP、HBV DNA检测情况 CHB患者HBV LP阳性率89.89%（80／89），明显高于HBV DNA的阳性率78.65%（70／89），差异有统计学意义（χ2＝4.238，P＜0.05）。

2.2 CHB患者HBV LP与HBV DNA的关系 随着HBV DNA拷贝数对数值增加，HBV LP吸光度值明显升高，其中HBV DNA拷贝数对数值＞7的患者HBV LP吸光度值明显高于其他患者（P＜0.05），见表1。相关性分析显示，HBV LP吸光度值与HBV DNA拷贝数对数值呈正相关（r＝0.846，P＜0.05），见图1。

图1 HBV LP与HBV DNA的相关性

2.3 CHB患者治疗后HBV LP、HBV DNA阳性率情况 70例HBV DNA阳性患者给予抗病毒治疗。治疗24周时，HBV DNA和HBV LP阳性率比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗48周时，HBV LP阳性率为48.57%，明显高于HBV DNA的阳性率（P＜0.05）。见表2。

表2 CHB患者治疗后HBV LP、HBV DNA阳性率比较 ［n（%）］

3 讨论

性接触、血源性感染等均能够增加HBV的感染风险，导致远期肝功能损害，增加肝脏纤维化的发生风险，特别是在合并有自身免疫力下降的人群中，CHB感染的风险可进一步的上升［7］。长期的临床随访研究发现，CHB感染后的病情迁延不愈的风险较高，疾病容易反复波动。现阶段临床上主要通过HBV DNA来评估患者体内病毒复制情况，判断抗病毒治疗终点。但单纯依靠HBV DNA指导CHB治疗的准确性较低，其评估停药时机的灵敏度不足45%［8］。部分患者在HBV DNA转阴、乙肝病毒表面抗原转阴后，病情仍然存在持续性进展的潜在风险，部分患者体内的乙肝病毒仍然存在低水平的复制［9］。

HBV表面抗原大蛋白前S区HBV LP的转录水平的差异，能够显著影响到下游DNA的扩增或者复制过程。过度转录的HBV LP能够通过其对启动子羧基末端的磷酸化修饰作用，进而提高转录区域启动子的转录活性，促进HBV DNA的过度释放。HBV LP能够通过其双跨膜蛋白的重组结构，通过反式调节机制，诱导HBV进入宿主细胞，激活宿主细胞膜内的蛋白激酶C系统，导致HBV DNA的持续性扩增［10］。基础方面的研究还认为，HBV LP的表达浓度的上升还能够参与到HBV Dane颗粒的组装和释放，参与肝脏上皮细胞膜完整性的破坏［11］。部分研究者已经探讨了HBV LP的表达与CHB患者的病情关系，认为HBV LP的表达上升与CHB患者的肝功能恶化密切相关［12］。

本研究发现CHB患者HBV LP阳性率明显高于HBV DNA阳性率，提示在CHB患者体内HBV LP的表达浓度可进一步上升，同时也提示HBV LP的表达同样也可能参与CHB患者的病情进展。HBV LP的表达上升主要通过下列途径影响病情进展［13，14］。①HBV LP的上升能够提高Dane病毒颗粒与宿主细胞整合效果，导致肝脏上皮细胞线粒体损伤程度的增加；②HBV LP的上升能够激活HBV DNA的上游转录过程，提高HBV DNA的正向扩增调控水平。张苏贞等［15］也探讨了不同病情的CHB患者血清学资料，发现HBV LP的表达阳性率可达75%以上，特别是早初次发病或者处于治疗后病毒复制稳定期的患者，HBV LP的表达阳性率可进一步上升。HBV DNA拷贝数量大于7的患者，血清HBV LP水平可进一步上升，同时HBV LP与HBV DNA的表达具有显著的相关关系，提示二者在促进CHB病情进展过程中可能发挥了重要协同作用。从原因上分析，这主要考虑与HBV LP的上调增加了HBV DNA的转录效能，导致上游C区基因转录调控水平的增强，从而增加了HBV DNA的拷贝速度。但部分研究者并不认为HBV LP与HBV DNA的表达具有普遍性，认为只有在合并有明显的CHB活动期表现的患者中，二者的表达才具有显著的线性关系，可能与HBV LP的检测灵敏程度、CHB患者的基础性病情差异较大有关。在治疗随访的过程中，虽然在治疗24周左右并未发现HBV LP与HBV DNA的表达差异，但随着随访时间的延长，可以发现HBV LP的表达阳性率明显高于HBV DNA，提示HBV DNA维持低水平时，HBV LP的阳性率仍然较高，此时的HBV LP检测仍然具有较高的临床指导价值。