非酒精性脂肪性肝病患者血清维生素D水平及其受体基因Bsm I位点多态性分析

2020-08-21 06:36钟伟传李镇武
中西医结合肝病杂志 2020年3期
关键词:多态性肝病基因型

胡 峦 李 艳 钟伟传 李镇武

1.深圳市龙华区人民医院全科门诊 (广东 深圳,518109) 2.深圳市龙华区人民医院检验科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)全球发病率约为25.24%,且随着生活水平的不断提高及饮食结构、生活习惯的改变,发病率呈上升且逐渐年轻化的趋势[1-3]。NAFLD是一种可逆性肝病,若能早发现、早诊断及早治疗,可预防甚至控制NAFLD的发生或发展[4-6]。NAFLD病因十分复杂,发病机制目前尚未完全明确,诊断金标准是肝穿刺活检,但创伤性强,不利于病情随访及疗效的判断[7]。因此,阐明NAFLD发病机制及寻找特异性临床诊断标记物,对NAFLD早期诊断、病情评估、疗效判断及预防具有重要意义。本研究对NAFLD患者和健康人群血清25-羟维生素D3[25-(OH)VitD3]水平及其受体(VDR)基因Bsm I位点多态性进行了调查,报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年3月至2019年6月来我院就诊并确诊为NAFLD的患者132例,其中男87例,女45例;年龄21~63岁,平均(37.52±13.27)岁;其中轻度69例、中度42例、重度21例。同时选择健康人群120例,其中男80例,女40例;年龄20~65岁,平均(36.23±11.97)岁。两组均排除高血压、高血脂、糖尿病、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、药物性肝炎、肝硬化、肾功能不全、心脑血管疾病、肝功能异常及长期每日饮酒量乙醇量男性>80 g、女性>40 g者,并确保两组患者的一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经同医院伦理委员会同意批准,并经同患者及家属知情同意,签定知情同意书。

1.2 NAFLD诊断标准及严重程度判断 参照2010年中华医学会肝病学组分会脂肪肝和酒精性肝病学组编著的《NAFLD诊疗指南》[8]。根据肝脏多普勒彩色超声结果判断NAFLD病情严重程度[9,10]:①肝区近场回声弥漫性增强(强于肾脏与脾脏),远场回声逐渐衰减;②肝内管道结构显示不清;③肝脏轻至中度肿大,边缘角圆钝;④肝内彩色血流信号减少或不易显示,但肝内血管走向正常;⑤肝右叶包膜及横幅回声显示不清或不完整。具有①项和②~④项中任何一项者为轻度脂肪肝,具有①项和②~④项中任何两项者为中度脂肪肝,具有①项和②~④项中任何两项及⑤项者为重度脂肪肝。

1.3 仪器与试剂 c8000全自动化学发光分析仪、试剂、校准品及室内质控品均由美国雅培公司提供;ABI7500 PCR基因扩增仪由美国ABI公司提供;DNA提取试剂由深圳亚能生物技术有限公司提供;25-(OH)VitD3试剂盒由索灵诊断医疗设备(上海)有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 标本采集 所有研究对象均于清晨空腹采集4~5 ml静脉血,其中2 ml加入EDTA-K2抗凝管内混匀用于全血DNA提取用,剩余的加入一次性无抗凝剂的干燥管内,室温静置30 min后于离心分离血清,用于25-(OH)VitD3检测。

1.4.2 25-(OH)VitD3水平测定 25-(OH)VitD3采用c8000全自动化学发光分析仪进行检测,所有操作均严格按照c8000分析仪和试剂说明书及科室内SOP操作规程进行。

1.4.3 全血DNA提取 采用深圳亚能生物技术有限公司提供的试剂盒提取全血中DNA,所有操作均严格按照试剂盒及仪器说明书进行,提取后采用紫外分光光度仪检测其浓度和纯度,合格后置于-20℃保存备用。

1.4.4 VDR基因Bsm I位点多态性分析 ①引物设计:上游引物5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′,下游引物5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′。②RCR扩增反应体系:反应总体积为30μl,其中DNA模板4.5μl,10μmol/L上、下游引物各1.5μl,2×Taq PCR Mix 15μl,去离子水7.5μl。③PCR扩增条件:94°C预变性2min,然后以94°C变性30 s→60°C退火30 s→72°C延伸1 min,循环35次,最后72°C延伸2 min。④PCR扩增产物电泳:取PCR产物10μl,加入Bsm I快速内切酶1μl,10×FastDigest Buffer2μl,去离子水17μl,37°C水浴5 min进行酶切,65°C水浴5 min终止反应。然后将酶切产物加入2%的琼脂糖凝胶电泳,于紫外凝胶成像系统下观察条带。⑤判断标准:于650bp和175bp处同时出现2条带的为bb基因型,仅于825bp处出现—条带的为BB基因型,于825bp、650bp和175bp处出现3条带的为Bb基因型。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件对所测数据进行统计分析,计量资料采用±s表示,两组间比较采用t检验,计数资料采用率(%)表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种人群血清25-(OH)VitD3水平比较 NAFLD患者血清中25-(OH)VitD3水平为(31.75±9.64)nmol/L,明显低于健康对照组的(60.58±16.93)nmol/L,差异有统计学意义(t=3.8254,P<0.05)。

2.2 不同程度NAFLD患者血清25-(OH)VitD3水平比较 重度NAFLD患者血清中25-(OH)VitD3水平为(18.15±4.94)nmol/L,明显低于中度的(29.01±5.73)nmol/L和轻度的(39.56±12.07)nmol/L,差异有统计学意义(t=2.9752~4.0852,P<0.05),且25-(OH)VitD3水平随NAFLD病情的加重而逐步降低,经Spearman分析,两者呈正相关(r=0.7902,P<0.05)。

2.3 两种人群VDR基因Bsm I位点多态性比较 经2%琼脂糖凝胶电泳,VDR基因Bsm I位点分别于825 bp、650 bp及175 bp处显色检出BB、Bb及bb 3种基因型带,结果见图1,见表1。

1、4为BB基因型;2、6为bb基因型;3、5为Bb基因型;M为标准标记物

表1 两种人群VDR基因Bsm I位点基因型及等位基因检出率比较 [n(%)]

2.4 不同基因型NAFLD患者血清25-(OH)VitD3水平比较 携带VDR基因Bsm I位点bb基因型的NAFLD患者血清中25-(OH)VitD3为(18.62±5.16)nmol/L,明显低于BB和Bb基因型的(43.29±12.84)nmol/L和(34.05±11.27)nmol/L,差异有统计学意义(t=3.2193~4.0264,P<0.05)。

3 讨论

NAFLD发病机制十分复杂,研究表明,NAFLD的发生和发展与胰岛素抵抗、脂质氧化、氧化应激、脂质代谢紊乱、免疫反应、细胞内毒素及基因多态性等诸多因素有密切关系,其中基因多态性突变在NAFLD 发生和发展中发挥着重要的作用[11,12]。因此,探索NAFLD患者基因多态性突变对预防、治疗、降低并发症及病死率至关重要。

维生素D是一种具有激素样作用的脂溶性类固醇物质,主要通过食物摄入或/和紫外线照射下皮肤合成两种途径获取[13]。维生素D除了调节钙、磷代谢外,还参与糖脂代谢、胰岛素合成和分泌、炎性反应、免疫及肿瘤等多种疾病的发生和发展。25-(OH)VitD3是维生素D的主要存在形式,其含量的高低直接反映人体维生素D储存水平。有研究表明,NAFLD患者血清中25-(OH)VitD3水平明显下降,且与NAFLD病情严重程度成正相关[7]。本研究结果显示,NAFLD患者血清中25-(OH)VitD3水平明显低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且与病变程度呈正相关,与何周桃等[7]及俞媛洁等[14]报道一致,这可能与25-(OH)VitD3水平降低引起体内糖脂代谢紊乱,使大量脂肪在肝细胞中沉积及脂肪酸氧化作用受抑等有关。

VDR是一种重要的基因转录调节蛋白,其基因位于12q13,由9个外显子和8个内含子组成,存在多个限制性内切酶酶切位点,在人体内分布广泛,可以通过对25-(OH)VitD3产生介导效应进一步发挥其生物学效应,能够维持骨代谢、免疫调节、细胞分化及内分泌平衡[15-17]。有研究表明,VDR基因Bsm I位点多态性发生基因突变能影响人体内25-(OH)VitD3的合成和分泌,导致机体脂质代谢和内分泌紊乱,与多种疾病如骨质疏松症、结核病、前列腺癌、牙周炎及NAFLD等的遗传易感性有关[18-21]。本研究结果显示,NAFLD患者血清中VDR基因Bsm I位点的bb基因型和b等位基因检出率明显高于健康对照组,与何周桃等[7]报道一致。且携带bb基因型的NAFLD患者血清中25-(OH)VitD3水平明显低于其他基因型,这表明了VDR基因Bsm I位点多态性突变与NAFLD的发生和发展有关,其中bb基因型可能是本地区NAFLD发病的危险易感基因之一,这可能与VDR基因Bsm I位点的bb基因型通过影响VDR mRNA的转录,抑制25-(OH)VitD3合成、分泌及其功能有关。

综上所述,NAFLD患者血清中25-(OH)VitD3水平明显下降,并随着病情加重而降低,与病情严重程度呈正相关。VDR基因Bsm I位点多态性突变与NAFLD的发生和发展中有关,其中bb基因型可能是引起NAFLD发病的危险易感基因之一,但不同地区和种族人群的遗传基因突变因遗传背景、生活方式及环境等诸多因素的不同而存在一定的差异。因此,加强VDR基因Bsm I位点多态性突变调查分析,对诊断、治疗及预防NAFLD有重要意义。

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