长链非编码RNA PSMA3-AS1在人胶质瘤细胞中的表达及作用研究

张 遥 范 丹

胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见、恶性程度最高的原发性肿瘤，调查发现在成人原发性脑肿瘤中约占70%，其中位生存期约9～12个月[1]。胶质瘤具有高度侵袭性，与周围脑组织无明显边界，手术无法全切，放化疗效果较差。因此，寻找胶质瘤的致病相关基因变得十分迫切[2-3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，由于缺少开放性阅读框，无法编码蛋白质。lncRNA可以在转录后或表观遗传等多个水平发挥重要作用[4-5]。PSMA3-AS1位于14q23.1染色体上，既往研究表明食管癌中高表达PSMA3-AS1的患者预后较差，提示PSMA3-AS1可能与肿瘤的发生发展密切相关[6]，但目前PSMA3-AS1在胶质瘤中的功能国内外尚无报道。本研究应用PSMA3-AS1的siRNA转染胶质瘤细胞，研究PSMA3-AS1在胶质瘤中的表达水平，进而探讨其生物学作用，为胶质瘤的发病机制及临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科于2010年1月—2016年1月行手术切除，并经病理证实的胶质瘤母细胞瘤组织35例，同时选取相应癌旁组织35例做对照。依据PSMA3-AS1表达水平的中位数，将组织分为高表达组和低表达组。纳入标准：所有患者均为首次诊断胶质瘤；首次进行手术治疗；术前未接收放疗、化疗等其他治疗；所有入组的研究对象均签署知情同意书。所有组织标本均在离体后 30 min内放入液氮中迅速冷冻备用。

1.2 细胞及试剂

人脑星形胶质细胞系HA购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)，人胶质瘤细胞系U251、LN229、T98和A172购自中科院上海细胞生物学研究所。链霉素、青霉素(北京Beyotime生物公司，中国)；小牛血清、DMEM高糖培养基(Hyclone，美国)；PSMA3-AS1的siRNA(上海吉玛公司，中国)；MTT细胞增殖检测试剂盒(北京Beyotime生物公司，中国)；总RNA抽提试剂盒使用(Invitrogen公司，美国)；逆转录反应试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(TAKARA公司，日本)；Lipofectamine 2000转染试剂，引物设计(Invitrogen公司，美国)；兔抗人MMP-2/9多克隆抗体，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(武汉Protein-tech公司，中国)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔/鼠二抗(北京中杉金桥公司，中国)。

1.3 TCGA数据分析

从TCGA数据库下载PSMA3-AS1表达谱数据(https：//tcga-data.nci.nih.gov/)。检测PSMA3-AS1在所有lncRNA中的表达水平和生存期信息，保留Fold Change值>2且P<0.01的排名前20的相关基因进行分析，计算PSMA3-AS1的表达与MMP2/9基因间的Pearson相关性，使用GO注释分析(https：//david.ncifcrf.gov/)研究PSMA3-AS1相关生物学功能。

1.4 细胞培养

胶质瘤细胞系U251、LN229、T98、A172U和星型胶质细胞使用体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在95%湿度、37℃、5% CO2培养箱内，培养细胞呈单层生长，实验采用对数生长期细胞。实验分为空白对照组(Negative Control，si-NC组)和敲低PSMA3-AS1组(si-PSMA3-AS1组)。

1.3 细胞转染

构建PSMA3-AS1的siRNA和Negative Control(si-NC)，转染胶质瘤细胞敲低PSMA3-AS1表达。使用Lipofectamine 2000转染试剂，按照说明书进行si-PSMA3-AS1和si-NC的转染。实验分组(si-PSMA3-AS1组)，Negative Control组(si-NC组)。Si-PSMA3-AS1序列F：5′-CCAGCAUCAAGAUGAUUUATT-3′；R：5′-UAAAUCAUCUUGAUGCUGGTT-3′。Si-NC序列F：5′-UUCUCCGAACGU GUCACGUTT-3′；R：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.4 qRT-PCR实验

收集50 mg冰冻组织及胶质瘤细胞，使用TRIzol法从组织和细胞中提取总RNA，对RNA进行纯化后，测定总RNA浓度。样品在37℃、15 min；85℃、5 s条件下反转录合成cDNA，使用SYBR Green PCR Kit(TAKARA)在ABI 7300 RT-PCR仪上进行检测。在95℃ 30 s 1个循环；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 30 s的条件下，进行实时定量PCR扩增反应。使用GAPDH作为内参，结果用相对表达量表示。PSMA3-AS1 F：5′-GAACAGAAACCAGAGCCA TA-3′；R：5′-CTGTTACTAGTTTGCGGCATC-3′；GAPDH F：5′-AAGGTGAAGG TCGGAGTCAA-3′；R：5′-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3′。使用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.5 Western blot检测

收集转染48 h后各实验组细胞，使用BCA法测定转染的胶质瘤细胞总蛋白浓度，取上清分装至于-80℃冰箱备用；随后进行SDS-PAGE电泳分离含有目标蛋白的样品，并原位湿转至PVDF膜，BSA封闭液室温封闭1 h后，分别使用一抗(MMP-2/9，1∶500；GAPDH，1∶1 000)在4℃孵育过夜。在HRP标记的二抗(1∶1 000)中室温孵育1 h；以ECL法显影，GAPDH作为内参分析结果。

1.6 细胞增殖实验

取对数生长期的细胞分别以2×103个/孔接种于96孔板中，培养达到60%融合度时进行转染，分别于24 h、48 h、72 h进行MTT法检测，每孔培养基体积200 μL，加入20 μL(5 mg/mL)MTT溶液，继续培养4 h后，终止培养，弃掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，水平摇床振摇10 min，使用酶标仪于490 nm波长处测定吸光光度值。

1.7 细胞侵袭实验

使用胰酶消化细胞，以无血清DMEM培养基调整细胞悬液密度为5×105个/mL，Transwell上室中加入200 μL细胞悬液，下室中加入500 μL 20%胎牛血清DMEM培养基。放入孵箱培养24 h后取出Transwell小室，使用PBS轻轻冲洗后，用棉签擦去小室上层细胞；将小室放入甲醇溶液中，室温固定20 min，结晶紫染液中5 min，蒸馏水冲洗2次。将小室放置在倒置显微镜下进行拍照及细胞计数(放大倍数，100×)。每个样本选取5个视野计数。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 lncRNA PSMA3-AS1在胶质瘤中表达情况

通过对TCGA数据库(n=162)进行分析，结果表明在胶质瘤组织中，PSMA3-AS1的表达较正常组织升高，且在检测到的差异表达水平排名前20位的lncRNA中评分最高，故选为候选lncRNA(图1A)，高表达PSMA3-AS1的患者与胶质瘤患者较短的总体生存期有关(χ2=7.985，P=0.042)(图1B)。随后通过对35例配对胶质瘤样本进行qRT-PCR验证，发现PSMA3-AS1在胶质瘤组织中的相对表达量显著升高(t=23.30，P<0.001)(图1C)。在多个胶质瘤细胞系中，PSMA3-AS1的表达较人脑星型胶质细胞NHA明显升高，且在U251和T98G细胞系中表达最高，故选择U251和T98G细胞系进行后续实验(P<0.05)(图1D)。GO功能富集分析提示PSMA3-AS1可能与胶质瘤的侵袭能力密切相关(图1E)。实验结果提示PSMA3-AS1可能在胶质瘤的发展中扮演重要角色。

图1 lncRNA PSMA3-AS1在胶质瘤中表达情况Figure 1 Expression of PSMA3-AS1 in glioma tissues and adjacent normal tissuesNote：A.Hierarchical clustering of differentially expressed genes in glioma tissue relative to normal tissues；B.The high expression of PSMA3-AS1 was correlated with a worse overall prognosis in patients with glioma(TCGA)；C.GO analysis was performed using the PSMA3-AS1 positive-associated genes in TCGA dataset；D.The expression of PSMA3-AS1 in 35 paired glioma tissues and adjacent normal tissues；E.The expression of PSMA3-AS1 in different glioma cell lines.(*P<0.05，***P<0.001，vs. Normal tissue or NHA cell)

2.2 胶质瘤中PSMA3-AS1的敲降效率

在U251、T98G细胞中转染siRNA后24 h进行qRT-PCR检测，与si-NC组相比，转染细胞中PSMA3-AS1的表达水平从48 h开始出现明显降低(P<0.05)，提示转染成功(图2A)。

图2 PSMA3-AS1对胶质瘤细胞增殖的影响Figure 2 PSMA3-AS1 promoted cell proliferation in glioma cellsNote：A.PSMA3-AS1 expression was efficiently knocked down by siRNAs in U251 and T98G cells as detected by qRT-PCR assay；B-C.The MTT assay showed that the knockdown PSMA3-AS1 could inhibit the proliferation of glioma cells.Each assay was performed in triplicate.(*P<0.05，**P<0.01，vs. si-NC)

2.3 PSMA3-AS1的表达与临床病理特征之间的关系

通过对35例胶质瘤患者PSMA3-AS1的表达情况与临床病理特征进行分析发现，PSMA3-AS1的表达与患者的肿瘤直径(P=0.007)有关(表1)。

表1 胶质瘤患者组织中PSMA3-AS1与临床病理因素的关系(n=35)

2.4 PSMA3-AS1对胶质瘤细胞增殖的影响

U251和T98G细胞转染si-PSMA3-AS1和si-NC后，使用MTT实验检测细胞增殖能力。结果显示，敲低PSMA3-AS1表达后，细胞的增殖能力从48 h出现明显降低(P<0.05)(图2B，2C)。

2.5 PSMA3-AS1对胶质瘤细胞侵袭能力的影响

敲低PSMA3-AS1后，Transwell实验提示U251和T98G细胞侵袭能力较si-NC组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)(图3A)。通过对TCGA数据库(n=162)进行分析，结果表明，在胶质瘤组织中，PSMA3-AS1与肿瘤侵袭标志物MMP2/9呈正相关(图3B，3C)(r=0.37，P=0.00024；r=0.26，P=0.00034)。

图3 PSMA3-AS1对胶质瘤细胞侵袭的影响Figure 3 PSMA3-AS1 promoted cell invasion in glioma cellsNote：A.Knockdown PSMA3-AS1 decreased the invasion ability of glioma cells；B-C.The correlation analysis was performed between PSMA3-AS1 expression with the expression of MMP2/9 in GBM samples from TCGA dataset(**P<0.01，***P<0.001，vs. si-NC).

Western blot实验显示在胶质瘤中敲低PSMA3-AS1后，MMP2和MMP9的表达水平明显降低(P<0.05)，以上结果提示敲低PSMA3-AS1表达后，可以通过下调MMP2和MMP9的表达，发挥抑制胶质瘤细胞侵袭的能力(图4)。

图4 PSMA3-AS1对侵袭相关蛋白的影响作用Figure 4 The effects of PSMA3-AS1 on invasion related proteins in glioma cellsNote：The expression of MMP2/MMP9 ratio was examined in U251 and T98G cells by Western blot(*P<0.05，vs. si-NC).

3 讨论

胶质瘤母细胞瘤是成人最常见、侵袭性最高的颅内恶性肿瘤，肿瘤发展迅速，具有边界不明确，预后较差等特点[7]。近年来，虽然胶质瘤的诊疗手段不断进步，但胶质瘤患者的中位生存期仍然较低。因此，研究胶质瘤形成的潜在原因和发病机制，对于发现胶质瘤靶向治疗新途径，改善临床治疗效果具有重要意义。

本研究通过TCGA数据库结合qRT-PCR实验证实胶质瘤组织和细胞系中PSMA3-AS1表达上调，推测PSMA3-AS1在胶质瘤中可以发挥促癌基因的作用。进一步通过转染siRNA，敲低PSMA3-AS1在U251和T98G细胞中的表达水平，通过细胞增殖和侵袭实验，发现敲低PSMA3-AS1表达后，胶质瘤的增殖和侵袭能力明显受到抑制。因此在胶质瘤中PSMA3-AS1的高表达可能发挥促癌作用。

既往研究证实lncRNA不仅参与转录激活、染色体沉默及周围蛋白编码基因的表达调控，还在多种疾病的发生发展中扮演了重要的角色[8-9]。胶质瘤中lncRNA TUG1呈低表达，可以通过抑制Bcl-2表达促进胶质瘤凋亡，发挥抑癌作用[10]。lncRNA UCA1通过“分子海绵”吸附作用调节miR-182表达，进而调控胶质瘤细胞的增殖和迁移能力[11]。Lu等[12]发现敲低lncRNA HULC可以通过PI3K/Akt信号通路发挥抑制白血病细胞增殖能力的作用。范宁宁等[13]发现lncRNA MEG3在胶质瘤中呈低表达，过表达MEG3可以通过抑制miR-21降低胶质瘤细胞的活力并促进其凋亡。目前PSMA3-AS1在肿瘤中的研究较少，研究显示食管癌中高表达的PSMA3-AS1可以通过miR-101/EZH2途径，调控食管癌的恶性生物学行为[6]。而外泌体中的PSMA3-AS1在多发性骨髓瘤的蛋白酶抑制剂化疗耐药过程中发挥重要作用，可以作为预测治疗反应的标志物[14]。

lncRNA的功能主要根据其在细胞内特定的分布区域，在细胞质或细胞核中通过各自的序列特殊性结合mRNA、miRNA及相关功能蛋白发挥功能，包括DNA甲基化；对mRNA稳定性的维持；通过“分子海绵”吸附miRNA；以及通过结合转录蛋白发挥转录调控的功能[15-16]。研究lncRNA具有调控多个miRNA表达的能力，而miRNA存在多个下游靶基因，说明lncRNA可能通过信号通路网络，协同促进胶质瘤细胞的侵袭迁移[17-18]。MMP2/9是肿瘤侵袭表型相关标志物，因此本文推测PSMA3-AS1可能作为ceRNA结合miRNAs，发挥调节MMP2/9表达的作用，进而调控胶质瘤的侵袭行为。

综上所述，本研究证实lncRNA PSMA3-AS1在胶质瘤中具有促癌作用，且与患者恶性预后呈正相关。进一步探讨及阐明PSMA3-AS1在胶质瘤的发生发展中的作用及相关分子机制，可以为lncRNA在胶质瘤的早期诊断和靶向治疗提供新的理论依据。