别隐品碱和原阿片碱在猪肝S9的代谢研究

赵雪娇，黄亚军，张明军，刘兆颖

(湖南农业大学动物医学院，湖南省兽药工程技术研究中心，长沙 410128)

博落回，系罂粟科博落回属植物，又名土霸王、号筒树等，以异喹啉类生物碱为主要活性成分，具有较强的生物活性[1]。在畜牧业中，以中国传统中医药理论为基础的中兽药饲料添加剂因具有效果好、无残留等优点被广泛关注。目前，作为中国首个二类中兽药制剂的博落回散已经得到了广泛应用，其主要活性成分为血根碱与白屈菜红碱。随着研究的深入，对博落回有效成分的研究也扩大了范围，普罗托品类生物碱在畜牧养殖与医药领域具有广阔的应用前景。至2019年，博普总碱及博普总碱散也被成功获批二类中兽药，推动了我国中兽药的现代化发展。

博普总碱的主要活性成分为ALL和PRO，在罂粟科、菊科、小檗科和毛茛科植物中广泛存在，是博落回等药用植物中的生物活性物质[2]。ALL和PRO具有许多已证实的生物活性，ALL具有抗菌[3]、抗寄生虫活性[4]、抗心律失常[5]和防治动物肝纤维化[6]等作用；PRO具有保肝[7]、抗寄生虫[4]、抗血小板凝集[8]、抗血栓和抗炎[9]等作用。近年来，对ALL和PRO的代谢研究主要集中于大鼠。杨丹莉等[10,11]对大鼠血浆和各组织进行了PRO的药效和药代学研究，证明PRO给药后在大鼠体内可迅速广泛分布和排泄。Huang等[2,12]用快速准确的HPLC-QqTOF-MS方法研究了大鼠肝S9样品中ALL和PRO的体外代谢和口服ALL和PRO后在大鼠尿液、血浆和粪便中的生物转化，在大鼠肝S9中共鉴定出8种ALL代谢物和5种PRO代谢物，在大鼠体内共鉴定了10种ALL代谢物和10种PRO代谢物，为ALL和PRO提供了更为全面的代谢特征。Guo等[13]研究了PRO大鼠药代动力学、组织分布和排泄，表明PRO只有于1.0%的排泄是PRO原形，即PRO主要是作为其代谢产物排泄的。目前可知， ALL和PRO的生物利用度很低，在肝脏中经历了首过代谢，在血浆中的浓度很低，然在尿液和粪便中的残留要高于大部分组织。因此，ALL和PRO在肝脏中的代谢机制研究就变得极为重要。为了扩大博落回在畜牧养殖中的应用范围，开展了ALL和PRO在猪肝S9中的代谢研究，根据前期对ALL和PRO代谢的研究和报道，用HPLC-QqTOF-MS对形成的代谢物进行了表征[12]。使用HPLC-MS/MS方法测定ALL和PRO在猪肝S9中的代谢物，与大鼠肝S9的体外代谢特点进行对比，总结各自的代谢规律和种属差异。其化学结构式如图1所示。

图1 ALL和PRO的结构图Fig 1 Structures of ALL and PRO

1 材料与方法

1.1 仪器 CF16RXⅡ型台式高速冷冻离心机，日立工机商业有限公司；HH·S/1-2-5数显恒温水浴锅，上海跃进医疗器械厂；AY220型电子天平，日本Electronic Balance公司；安捷伦(1290)HPLC-(6530)QTOF液相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.2 试剂 别隐品碱和原阿片碱购自湖南美可达生物资源有限公司，含量≥98%；还原型辅酶Ⅱ(NADPH)购自Roche公司；甲酸和乙腈购自上海安谱科学仪器有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、蔗糖、乙二胺四乙酸(EDTA)和氯化镁等试剂均为分析纯，水为Milli-Q水。试剂配制见表1。

表1 试验所需试剂的配制(保存于4 ℃)Tab 1 Preparation of reagents (stored at 4 ℃)

1.3 猪肝S9的制备 猪经颈静脉放血处死后，打开胸腹腔，暴露肝脏后取出，迅速吸取生理盐水冲洗样品表面残血。用锡箔纸包好后立即置于液氮中充分冷却，随即转入-70 ℃冰箱保存待用。试验时，放置室温解冻，称取3.0 g肝组织，用Tris-HCl溶液再次清洗除去表面血液成分后，用匀浆器以1.0 g 肝组织加入4 mL Tris-HCl匀浆缓冲液的比例，制备得到肝匀浆。置于9000 G，4 ℃离心20 min取得上清液，此为肝S9。将其保存于-70℃冰箱。以上所有的操作都在冰浴上进行。

1.4 色谱和质谱条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil GOLD 柱(150 mm×2.1 mm I.D.，粒径5 μm)；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；水相：0.1%甲酸水；有机相：乙腈；洗脱梯度(水相比例)：0～5 min，90%；5～20 min，90%～10%；20～25 min，10%；25.1～30 min，90%。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源(EIC)(正离子模式)扫描范围50～1000 (m/z)，使用液氮作为雾化气(流速：9 L/min，压力：35 psig)，鞘气温度和流速分别为350 ℃、11 L/min，喷嘴电压和毛细管电压分别为1和4 kv，碰撞能量30 eV。

1.5 ALL、PRO分别与猪肝S9孵育代谢 取1.5 mL离心管，分别加入40 μL的MgCl2、猪肝S9、NADPH，反应终浓度分别为5 mmol/L、2 mg/mL、2 mmol/L，再加入40 μL Tris-HCl溶液置于37 ℃水浴锅中预反应2 min，最后加入40 μL 终浓度20 μg/mL的ALL或PRO，恒温反应60 min。待反应完全后，加入50 μL 15%三氯乙酸终止反应，混匀后于4 ℃、12000 G离心15 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜，待用。

2 结果与分析

2.1 ALL和PRO在猪肝S9中的代谢产物

2.1.1 ALL在猪肝中的代谢产物分析 使用仪器自带软件预测ALL在猪肝S9中的碎片离子的分子组成和分子式，研究得到4种代谢产物。ALL在猪肝S9的EIC和MS/MS见图2，4种代谢产物见图3。与本实验室前期的试验结果对比可知，分别为AL1、AL3、AL4、AL5。ALL的裂解途径、结构鉴定与代谢产物分析可详见本实验室前期试验文章[12]。表2总结了ALL在猪肝S9中代谢物的保留时间、分子组成及其结构鉴定。

图2 ALL精确的EIC(A)和MS/MS图(B)Fig 2 Accurate EIC (A) and MS/MS (B) of ALL

图3 ALL在猪肝S9中代谢物AL1+AL3(A)、AL4(B)、AL5(C)的EIC图Fig 3 Accurate EIC of metabolites AL1+AL3(A),AL4(B) and AL5(c) in pig liver S9

表2 ALL在猪肝S9中代谢物的保留时间、元素组成、实测值、预测值及鉴定结果Tab 2 Retention time, element composition, measured value, predicted value and identification results ofALL metabolites in S9 of pig liver

2.2.2 PRO在猪肝中的代谢产物分析 在猪肝S9中，对PRO的碎片离子的分子组成和分子式进行预测，PRO的EIC和MS/MS见图4，代谢产物见图5。研究获得PRO的3种代谢产物。参考实验室前期成果[12]可知PRO详细的裂解途径、结构鉴定和代谢产物分析，3种代谢物分别为PR2、PR3、PR4。表3为PRO在猪肝S9中代谢物的保留时间、分子组成及其结构鉴定。

表3 PRO在猪肝S9中代谢物的保留时间、分子式、实测值、预测值及鉴定结果Tab 3 Retention time, molecular formula, measured value, predicted value and identification results ofPRO metabolites in S9 of pig liver

图4 PRO精确的EIC(A)和MS/MS图(B)Fig 4 Accurate EIC (A) and MS/MS (B) of PRO

图5 PRO在猪肝S9中代谢物PR2+PR3(A)、PR4(B)的EIC图Fig 5 Accurate EIC of metabolites PR2+PR3(A)andPR4(B) of PRO in pig liver S9

3 讨论与结论

猪肝S9中检出了ALL的4种代谢产物。根据前期做过的结构鉴定[12]，通过保留时间与实测值4种代谢物可判定为AL1、AL3、AL4、AL5，且4种代谢产物的含量很低，ALL在猪肝S9中主要的代谢物同大鼠肝S9一样为AL4和AL5，这两种代谢物在猪肝S9中的浓度约等于大鼠肝S9中代谢产物浓度的1/10，而AL1和AL3则略低。表明ALL在2种动物肝S9中的代谢存在着种属差异。ALL经环裂后产生的AL2在猪肝S9未检测到。但是检测到了其发生甲基化和O-去甲基化的代谢产物，这一有意思的现象表明在猪肝S9中AL2可能是AL3和AL4的主要来源途径。由图3和图6可知，O-去甲基化在猪肝S9中是明显的代谢途径，其次为甲基化和氧化。亚甲二氧环环裂后的去甲基化在猪肝S9中可能是不可忽视的代谢途径。

图6 基于文献[12]，ALL在大鼠和猪肝S9可能的代谢途径Fig 6 The possible metabolic pathways of ALL in S9 of rat and pig liver based on literature [12]

猪肝S9中检出了PRO的3种微量代谢产物。即PR2、PR3和PR4，且均为已报道的代谢产物[14,15]。对比PRO在2种动物肝S9中代谢物的EIC图发现[12]，PR4代谢物的浓度在二者之间相近，但PRO在猪肝S9中的PR2和PR3代谢物浓度明显低于大鼠肝S9中的代谢物浓度，表明PRO在2种动物肝S9中存在着种属差异。PRO在猪肝S9的代谢率要低于大鼠，可能是在猪肝S9中生物酶催化PRO去甲基化的能力低于大鼠肝S9。同为环裂后的去甲基化，2,3-亚甲二氧环环裂后的去甲基化代谢物PR2的含量要高于9,10-亚甲二氧环的环裂后去甲基化代谢物PR3，指向PRO在猪肝S9中的主要代谢产物是亚甲二氧环的去甲基代谢物PR2和PR4，其次为O-去甲基化代谢物PR3。结合图5和图7可知，亚甲二氧环的环裂后去甲基化是PRO在猪和大鼠肝S9中的主要代谢途径，其次为O-去甲基化。值得一提的是PR4经代谢产物分析鉴定为别隐品碱，两种生物碱之间的通过生物酶的作用进行生物转化的现象为普罗托品生物碱的深入研究提供方向。

图7 基于文献[12]，PRO在大鼠和猪肝S9可能的代谢途径Fig 7 The possible metabolic pathways of PRO in S9 of rat and pig liver based on literature[12]

本研究采用体外肝S9体系研究了普罗托品类生物碱ALL和PRO在猪肝脏的体外代谢，在猪体外肝S9中共鉴定了7种ALL和PRO的代谢物，且均为已经报道过的代谢物。结果表明，ALL和PRO在猪肝S9中存在低水平残留，与大鼠肝S9的体外代谢相比均存在种属差异，且在猪体外肝S9中的代谢率明显低于大鼠。这一现象可能与代谢酶种类和数量有关。ALL和PRO在猪体外的主要代谢途径，与大鼠的主要代谢途径相同。二者的种属差异暗示着药物代谢酶ALL和PRO的关键酶。随着畜牧养殖和医药领域的不断应用，以及兽药科学的不断发展，对普罗托品类生物碱的代谢酶机制将会有更深入的研究。