牛奶中兽药残留限量新国标及主要检测方法的国内外比较分析

解书斌，韩伟，阎玉林，于忠娜

(1.青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200；2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109；3.青岛海关技术中心，山东青岛 266002；4.青岛谱尼测试有限公司，山东青岛 266100)

Turnipseed SB等[1]提出兽药是一类应用广泛的药物，具有许多不同的化学和治疗特性。兽药残留是指在动物中使用兽药可能会使母体化合物、代谢产物或结合物的残基留在经治疗的动物衍生的食品中，牛奶中的兽药残留是养殖过程中兽药滥用导致的。兽药残留过量对人体健康有着严重影响，若长期食用兽药残留超标的食品，则可能导致人体兽药残留蓄积，引起人体毒害损伤，以及病原体耐药性的产生，甚至致畸、致癌[2]。为应对牛奶中兽药残留超标问题世界各国和组织都已制定了相关的法律法规和监控体系。我国于2019年9月6日发布，即将于2020年4月1日正式实施的食品安全国家标准GB 31650-2019[3]重新修订了食品中兽药最大残留限量标准，替代农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》相关部分。本文重点对兽药残留的种类以及兽药最大残留限量值、检测方法等方面进行分析。

1 牛奶中兽药残留的种类及最大残留限量

1.1 GB 31650-2019对牛奶中兽药残留规定 本标准规定了牛奶中阿苯达唑等81种兽药的最大残留限量，对81种兽药按照其用途分类，共涉及五种兽药类型，分别为抗菌类、抗寄生虫类、激素类、消炎镇痛类、农药除虫类，具体结果见图1。标准中所规定的抗菌类兽药数量最多，有37种，占国标所涉及兽药种类的45.7%。抗菌类药物有10种不同类型，包括β-内酰胺类(9种)、氨基酸糖苷类(6种)、喹诺酮类(4种)、大环内酯类(4种)、四环素类(4种)、多肽类(2种)、磺胺类(2种)、酰胺醇类(2种)、林克胺类(2种)，以及抗菌增效剂(2种)。其次为抗寄生虫类兽药有25种，约占标准涉及兽药种类的30.9%，其中抗线虫类药物最多，有12种；其次为抗吸虫和球虫药物各4种，抗锥虫、滴虫、梨形虫药物相对较少，分别为2种、2种、1种；农业除虫类兽药有9种，约占涉及兽药种类的11.1%；激素类药物有6种，约占涉及种类的7.4%，其中糖皮质激素类药物有2种，性激素药物3种；神经类药物3种，约占3.7%；消炎镇痛类药物1种，仅占1.2%。

图1 81种兽药残留最大残留限量种类数量比较Fig.1 Comparison of the number of 81 types ofveterinary drug residue maximum residue limits

1.2 GB 31650-2019牛奶中兽药残留规定与农业部公告第235号比较分析 自2002年中华人民共和国农业部公告第235号发布到如今已有17年，第235号公告对59种牛奶中兽药检出最大限量做出了标准，食品安全国家标准GB 31650-2019对第235号公告做出了补充及修改，增加了23种牛奶兽药残留检出最大标准，具体见表1。增加的牛奶兽药最高检出限量标准中以抗寄生虫类兽药为最多，有12种；抗菌类药物有5种，其中大环内酯类抗生素2种；农业除虫剂4种；激素以及消炎镇痛类各1种。同时GB 31650-2019对7种牛奶中兽药残留检出最高限量进行了修改。新国标增加了多拉菌素、新霉素、泰乐菌素的兽药残留最大检出标准，其中新霉素、泰乐菌素的最高检出限分别增加了200%和100%，多拉菌素由牛奶中不得检出更改为最大检出限量为15 μg/kg，而农业杀虫类药物辛硫磷在新国标中却未做最大检出限量规定，具体见表2。

表1 新国标相比旧国标新增兽药检出限标准Tab 1 New veterinary drug detection limit standardscompared with the old national standard

表2 新国标与第235号公告兽药检出限变化Tab 2 New national standards and announcementNo.235 changes in detection limits of veterinary drugs

1.3 我国与国外主要乳品贸易国家兽药残留检出标准比较分析 为保障国内和国际乳品流通的安全性，保障人民身体健康，全球各国与组织都对牛奶中兽药残留最大检出限量做出了规定，乳品质量安全不达标，兽药残留检出过量的产品禁止进入市场并禁止国际流通。针对牛乳中兽药残留检出限量问题，共搜集了7个世界上主要的乳品贸易国家及组织规定的牛奶中兽药残留检出限量标准，从规定兽药的种类、数量等方面进行了分析。

不同国家和组织所规定的牛奶中兽药残留限定的数量之间有较大的差异，如图2所示。日本是所调查国家或组织中规定兽药残留限定数量最多的国家，2019年日本肯定列表中所规定的兽药残留数量高达355种[4]；澳大利亚位居其次，2019年规定了319种兽药残留限量[5]；欧盟规定了牛奶中111种兽药残留限量[6]；中国新国标规定牛奶中兽药残留限量数量为81种，紧随其后；新西兰2019年所规定牛奶中兽药残留数量为55种[7]；2018年加拿大兽药署以及国际食品法典委员会CAC(Codex Alimentarius Commission)修订兽药残留标准(CX/MRL 2-2018)，两者规定的限定数量相当，分别为37、36种[8-9]。

图2 主流国家或组织规定牛奶中兽药残留最大残留限量种类数量比较Fig 2 Comparison of the number of types of maximumresidue limits for veterinary drug residues in milkregulated by mainstream countries or organizations

本文还对各牛奶生产销售主流国家及组织的不同用途的兽药种类数量进行了比对分析，结果见图3。不同国家或组织对不同类型兽药残留的限量数量的规定各不相同，各国及组织对抗菌药的规定数量所占比重普遍较大，除了日本、澳大利亚所占比例较低，分别为30.4%、28.8%，其余国家或组织抗菌药物所占比例均已达到45.0%以上。中国仅次于加拿大以及CAC，所占比例为45.7%；其次为杀虫剂和抗寄生虫类药物，其中杀虫剂类药物除加拿大并未对兽药残留限量作规定外，其余各国、组织规定限量数量占比均在10.0%以上，日本和澳大利亚更是占到了32.4%和26.0%，而中国只占11.1%；抗寄生虫类药物各国、组织规定限量数量差异较大，中国、CAC所占比例最高分别为30.9%和24.3%，而日本、澳大利亚、新西兰三个国家抗寄生虫药规定限量数量占比较低，分别为0.48%、5.6%、7.3%；除草剂类药物，仅有日本、澳大利亚、新西兰有所涉及，特别是澳大利亚和日本除草剂类药物规定限量数量占比高达34.5%和21.4%，新西兰为16.4%；激素类药物，除新西兰外各国或组织都有涉及，其中中国占比最大，为7.4%，欧盟和CAC位居其次为5.4%，日本、澳大利亚两国规定激素类药物限量数量分别为6种和1种，所占比例仅为1.7%和0.3%；植物生长调节剂类药物，仅有日本、澳大利亚两国做出了限量规定，其余几国或组织并未涉及；此外本文所涉及到的所有兽药种类，仅有日本、澳大利亚涉及到了全部7种兽药类型，其他国家或组织主要对除草剂以及植物生长调节剂类药物没有涉及。

图3 不同用途兽药残留在各个国家或组织中的分布比较Fig 3 Distribution comparison of veterinary drug residues for different purposes indifferent countries or organizations

2 牛奶中主要兽药残留检测方法比较

近年来食品安全问题越来越引起人们的重视，国家虽然对动物用药限量已有了明确规定，但农场为追求经济效益、减少损失，依然会不顾风险加大用药量，牛奶中的兽药残留问题也日渐严重，兽药残留的检测方法更是得到了极大的发展与完善，目前国内外关于牛奶中兽药残留的检测方法主要分为4大类[10]：仪器分析法、免疫法、适应体传感器检测法以及微生物法。

2.1 仪器分析法 仪器分析法是检测牛奶中兽药残留应用最广泛的方法，该方法根据兽药中的特异性基团或标志性物质的反应等来测定其含量。仪器分析法需要对样品进行复杂的前处理，迫使兽药特异性基团或标志性物质与牛奶中成分分离[11]，而后用仪器进行定性或定量分析。现行仪器分析法主要包括色谱法和光谱法[12]。色谱法主要有：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱质谱联用法(GC/MS、GC/MS-MS、LC/MS、LC/MS-MS、TLC/MS)。光谱法主要有：近红外光谱法(FT-NIR)、中红外光谱法(FT-MIR)。国内多采用气相色谱和质谱(GC-MS)联用技术定性和定量分析食品中残留物，对于热不稳定的化合物则用HPLC-MS技术进行确认分析。欧盟采用色谱分离与放免技术的联用和免疫亲和色谱等技术来分析动物组织中的抗生素、黄曲霉毒素、激素和β-激动剂等[13]。2013年Cámara等[14]建立了一种利用高效液相色谱结合二极管阵列检测器可同时检测多种β-内酰胺类兽药的方法。兽药残留检出限达到3.4～8.6 μg /L，满足国家最低残留限量的要求。Yu等[15]建立了一种简单、灵敏、高效的牛奶和奶粉中兽药残留检测技术，该方法利用C18搅拌棒吸附萃取技术结合高效液相色谱-串联质谱技术可对牛奶中6种磺胺类药物实现快速检测。Lv 等[16]建立了一种利用固相萃取结合高效液相色谱检测样品中四环素类药物残留的新方法。

2.2 微生物检测法 微生物检测法又叫做微生物抑制试验(microbial inhibitions test, MIT), 牛奶中的残留物微生物抑制剂测试最早可追溯到1952年。该方法主要应用在抗生素残留量的检测[17]，由于抗生素能对微生物的新陈代谢和生理机能产生抑制作用，所以可以用来检测并计算出牛奶中兽药残留量，检测方法主要有三种：微生物抑制法、微生物受体法和酶比色法，常见的检测方法有氯化三苯基四氮唑法(TTC法)和微生物受体检测法等[18]。MIT法是以嗜热脂肪芽孢杆菌为指示菌，该菌对多种抗生素十分敏感，而对青霉素类和头孢菌素类尤为敏感。我国较早和较多使用的是荷兰DSM Foods公司的戴尔沃系列，该系列MIT试剂盒最早开发于50年代，目前已成为全球公认的乳品抗生素残留的检测方法[13]。TTC法适用于能杀灭或抑制嗜热乳酸链球菌的各种常用抗生素或消毒剂的检验, 最初选择嗜热乳酸链球菌是因为此菌对牛乳中青霉素较为敏感, 该方法1955年4月1日起在我国生效为法定方法，并最终被GB/T 4789.27-2008替代。

Kumar等[19]利用微生物检测法对牛奶中的萌芽芽孢和休眠孢子进行了兽药残留抑制实验，来判定并检测兽药残留情况。该项研究表明此方法或可以用于奶制品产业，但因检测灵敏性与选择性较差，仅能做半定量的检测。Samsonova等[20]建立了检测多种不同类型食品中兽药(氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素)残留的方法并选择了微生物抑制法、免疫法、以及生物传感器检测法，对三种方法的优劣进行了比较分析，论述了未来兽药残留检测方法的发展趋势。Yamaki等[21]使用微生物检测法对西班牙的一个牧场中的羊奶中残留的兽药进行了分析，结果表明样品中的阳性率为2.6%，其中β-内酰胺类兽药大约为25%，但是该方法存在一定的假阳性，且灵敏度有待提高。

2.3 免疫法 免疫法是根据抗体与抗原之间的高选择性特异结合为基础而建立的检测方法[22-23]。抗原与抗体间的结合具有高度的敏感性与特异性，根据标记抗体或抗原与对应适配体进行反应呈现出的函数关系，此方法可以对牛奶样品中的兽药残留进行定性或定量分析。利用免疫法原理建立的一系列便捷、高效的检测方法已被广泛应用于牛奶兽药残留检测[24]。最常见的有快速检测试纸卡、放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA试剂盒法)。目前分析ELISA试剂盒正在兴起，并不局限于乳品抗感染药物的检测，其他兽药如激素残留、抗寄生虫药物，以及农药残留、微生物毒素残留都已有针对的ELISA试剂盒。2001年12月国家质量监督检验检疫总局推荐Randox公司的ELISA试剂盒作为动物激素、抗生素残留的首选筛选试剂。Charm Ⅱ 7600是现有的快速放射性检疫检测技术中最为成功的例子。该检测系统就是利用细菌的专一性受体来识别、结合同一类抗生素族中的母环为工作原理而建立起来的、较为快捷的生物放射检测技术，能同时检测同一抗生素族在样品中的残留情况, 是现有的快速放射性检疫检测技术中最为成功的例子。目前Charm Ⅱ 7600检测系统对β-内酰胺类、氯霉素类、四环素类、磺胺类、邻氯青霉素及碱性磷酸酶等7项检测已被FDA认证[13]。2016年Chen等[25]建立了荧光偏振免疫分析法，通过异硫氰酸荧光素标记的兽药，在黑暗条件，示踪剂与抗体结合，然后测量加入不同浓度的药物与示踪剂竞争结合抗体后的荧光偏振值，进而高灵敏度检测奶制品中克林沙星的残留。Pennacchio 等[26]利用免疫传感器方法检测牛奶中的青霉素G，该方法可以直接地应用于检测牛奶中青霉素G的残留，而不受其他物质的干扰。

2.4 适应体传感器检测法 核酸适配体概念的提出最早可追溯到1990年[27]。核酸适配体能与多种目标物实现特异性结合，适配体与靶向目标物结合后会发生结构上的改变，根据核酸适配体的这一特性，可用适配体作为探针检测多种目标物，包括霉菌毒素、兽药残留、重金属等[28-29]，由于适配体是一段特定DNA序列，可不受自然及物理条件约束直接体外合成并且其结构稳定，现已受到研究人员广泛关注[30]。2013年Sun等[31]开发了一种基于石墨烯-纳米金离子等多种复合材料之间协同的适配体传感器，该适配体传感器可用于牛奶中卡那霉素的检测。

3 展 望

自2002年中华人民共和国农业部公告第235号发布到如今已有17年，第235号公告对59种牛奶中兽药检出最大限量做出了标准，2019年9月6日发布，即将于2020年4月1日正式实施的食品安全国家标准GB 31650-2019对第235号公告做出了补充及修改，增加了23种牛奶兽药残留检出最大标准，并对7种兽药残留检出最大限量做出了修改，进一步完善了国内兽药使用规范和标准，而对比世界上主要乳品贸易国家如日本、澳大利亚的限量规定数量上还有一定的差距，特别是在除草剂类药物和杀虫剂类药物的限量规定上，国内没有规定或是规定比例较少。

近年来食品安全问题越来越受重视，随着科技的发展和生物化学领域的不断探索，人类为应对动物性疾病做出了诸多努力，特别是在动物疾病用药方面，新型特效药物不断研发制造，这就导致了兽药数量繁多，国家标准法规更新不及时，内容涵盖不全，从而使食品生产厂家无法规可依，无标准参照。同时农场为追求经济效益、减少损失，依然会不顾风险加大用药量，牛奶中的兽药残留问题得不到根本的解决，为应对兽药残留问题，应尽快完善食品兽药残留法规、最大残留限量标准和监管体系，积极有效的控制牛奶中兽药残留问题。