双黄连口服液质量分析

吴雪琴，王胜义，王磊，王富河，吴亮红，崔东安，孙研

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州 730050)

中兽医药作为我国兽医医疗系统的重要组成部分，在疾病预防和治疗方面发挥着重要作用。在全球高度重视细菌耐药性和抗生素慎重使用背景下，中兽药逐步成为保障动物源食品安全的重要战略工具[2]。另一方面，绿色、无抗的中兽药亦成假兽药盛行的重灾区。由农业农村部组织的兽药质量监督抽检和风险监测报告结果显示，中药类产品不合格率偏高，不合格项目主要集中在产品性状、鉴别、检查项和含量等，并有些中兽药产品中检出非法添加物[3-4]。因此，监测中兽药产品质量总体水平和状态，发现可能影响药品质量与安全的因素及隐患，为进一步强化对中兽药产品质量的监管、不断提高中兽药产品安全有效和质量水平的可控、保障动物用药安全和动物源食品安全提供有力的技术支撑。

双黄连口服液由金银花、黄芩和连翘三味中药提取精制而成，具有辛凉解表、清热解毒的功效[1]。现代药理学研究表明，双黄连口服液具有广谱抑菌[5]、抗病毒[6]、解热抗炎[7]、免疫调节[8]等作用。在治疗畜禽感冒、炎症、病菌感染等疾病的临床效果好，而且其毒副作用小，因此在兽医临床的应用广泛。同时，双黄连制剂，组方精简，疗效确切，因此是兽药企业青睐的产品，目前有1245个兽药企业具有双黄连制剂的生产批准文号，其中有569个企业生产双黄连口服液。

研究以双黄连口服液产品为研究对象，依据2015版《中国兽药典》二部双黄连口服液质量标准，采用薄层色谱法和高效液相色谱法，分析双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸和连翘苷的色谱特征和含量，对市售双黄连口服液进行质量考察，为进一步提升双黄连口服液质量控制提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品和对照品 在市面上随机购买18个不同厂家的药品，将其进行编号1-18。绿原酸对照品(110753-201817)、黄芩苷对照品(110715-201821)、连翘苷对照品(110821-201816)。

1.1.2 仪器与试剂 高效液相色谱U-3000(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；SP-20E全自动点样仪(上海科哲生化科技有限公司)；GoodLook-1000型全自动薄层色谱成像系统(上海科哲生化科技有限公司)；SGel型电动喷雾器(德国DESAGA公司)；ME235S型微量分析天平(赛多利斯公司)；AL104电子天平(梅特勒-托利多有限公司)；KH5200型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；硅胶G板200 mm×100 mm(青岛海洋化工厂生产)；聚酰胺薄膜(国药集团化学试剂有限公司)；中性氧化铝柱(Agela Techologies)；精密鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)

甲醇、乙腈为色谱纯；乙醇、醋酸、三氯甲烷、硫酸等为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 定性鉴别[1]

1.2.1.1 黄芩苷、绿原酸的定性鉴别方法[1]供试品溶液的制备：分别量取18个厂家的双黄连口服液1 mL，分别加75%乙醇溶液5 mL，摇匀，既得。

对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品11.49 mg、绿原酸对照品1.14 mg，加入75%乙醇分别定容在10 mL量瓶中，浓度为1.122和0.114 mg/mL。

方法测定：照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以36%乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365 nm下检视。检查供试品色谱中，在与黄芩苷对照品、绿原酸对照品色谱相应的位置上，是否显相同颜色的荧光斑点。

1.2.1.2 连翘苷的薄层鉴别方法[1]供试品溶液的制备：分别量取18个厂家的双黄连口服液1 mL，分别加甲醇5 mL，摇匀，静置，取上清液，既得。

对照品溶液的制备：精密称取连翘苷对照品5.13 mg，加甲醇定容在10 mL量瓶中，浓度为0.513 mg/mL。

方法测定：照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。检查供试品色谱中，在与连翘对照品色谱色谱相应的位置上，是否显相同颜色的斑点。

1.2.2 含量测定

1.2.2.1 黄芩苷、绿原酸含量测定[1]色谱条件：Waters Symmetry© C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相∶乙腈为A、0.4%磷酸溶液为B如表1梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；柱温:30℃；检测波长324 nm；在上述色谱条件下，理论塔板数按绿原酸峰计算不应低于6000。

表1 黄芩苷、绿原酸洗脱梯度表Tab 1 Gradient table of Baicalin and chlorogenicacid elution

供试品溶液的制备：分别精密量取18个厂家的双黄连口服液1 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20 min，放置至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得。每个样品平行3次。

对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品20.20 mg，绿原酸对照品1.53 mg，分别置100 mL量瓶中，加50%甲醇定量使溶解并稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得。

样品含量测定：在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和不同厂家供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪。

结果分析：根据对照品、供试品的峰面积，以外标法计算样品中黄芩苷、绿原酸的含量，用SPSS21.0进行分析，结果以平均值±标准偏差表示。

1.2.2.2 连翘苷含量测定[1]色谱条件：Waters Symmetry© C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相∶乙腈∶水(25∶75)；检测波长278 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温:30 ℃；在上述色谱条件下，理论塔板数按连翘苷峰计算不应低于6000。

供试品溶液的制备：分别精密量取18个厂家的双黄连口服液1 mL，分别加在中性氧化铝柱(100～12目，6 g，内径为1 cm)上，用70%乙醇40 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加50%甲醇适量，温热使溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得。每个样品平行3次。

对照品溶液的制备：精密称取连翘苷对照品6.46 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇定量使溶解并稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得。

样品含量测定：在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和不同厂家供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，检测。

结果分析：同1.2.2.1黄芩苷、绿原酸含量测定分析方法。

2 结 果

2.1 定性鉴别结果

2.1.1 黄芩苷、绿原酸定性鉴别结果 黄芩苷、绿原酸薄层色谱鉴别结果见图1～图7，供试品色谱中，样品1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、18中的黄芩苷，样品1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、15、16、18中的绿原酸在与对照品色谱相应的位置上有相应的斑点，而样品8、9、14、15、17中的黄芩苷，样品9、14、16、17中的绿原酸在与对照品色谱相应的位置上无相应的斑点。

图1 1-3:双黄连口服液样品3.2.1；4:绿原酸对照品；5:黄芩苷对照品Fig 1 1-3: Shuanghuanglian oral liquid sample 3.2.1；4: Chlorogenic Acid reference substance；5: Baicalin reference substance

图2 1-3:双黄连口服液样品6.5.4；4:绿原酸对照品；5:黄芩苷对照品Fig 2 1-3:Shuanghuanglian oral liquid sample 6.5.4；4:Chlorogenic Acid reference substance；5:Baicalin reference substance

图3 1-3:双黄连口服液样品8.7.6；4:绿原酸对照品；5:黄芩苷对照品Fig 3 1-3: Shuanghuanglian oral liquid sample 8.7.6；4: Chlorogenic Acid reference substance；5: Baicalin reference substance

图4 1-2:双黄连口服液样品10.9；3:绿原酸对照品；4:黄芩苷对照品Fig 4 1-2:Shuanghuanglian oral liquid sample 10.9；3:Chlorogenic Acid reference substance；4:Baicalinreference substance

图5 1-3:双黄连口服液样品13.12.11；4:绿原酸对照品；5:黄芩苷对照品Fig 5 1-3:Shuanghuanglian oral liquid sample 13.12.11；4:Chlorogenic Acid reference substance；5:Baicalinreference substance

图6 1-3:双黄连口服液样品16.15.14；4:绿原酸对照品；5:黄芩苷对照品Fig 6 1-3:Shuanghuanglian oral liquid sample 16.15.14；4: Chlorogenic Acid reference substance；5: Baicalinreference substance

图7 1-2:双黄连口服液样品18.17；3:绿原酸对照品；4:黄芩苷对照品Fig 7 1-2:Shuanghuanglian oral liquid sample 18.17；4:Chlorogenic Acid reference substance；5:Baicalinreference substance

2.1.2 连翘苷定性鉴别结果 连翘苷薄层色谱鉴别结果见图8～图12，供试品色谱中，样品1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13中的连翘苷在与对照品色谱相应的位置上有相应的斑点，而样品9、14、15、16、17、18中的连翘苷在与对照品色谱相应的位置上无相应的斑点。

图8 1-4:双黄连口服液样品4.3.2.1；5:连翘苷对照品Fig 8 1-4:Shuanghuanglian oral liquid sample 4.3.2.1；5:Phillyrin reference substance

图9 1-4:双黄连口服液样品8.7.6.5；5:连翘苷对照品Fig 9 1-4:Shuanghuanglian oral liquid sample 8.7.6.5；5:Phillyrin reference substance

图10 1-2:双黄连口服液样品10.9；3:连翘苷对照品Fig 10 1-2:Shuanghuanglian oral liquid sample 10.9；3:Phillyrin reference substance

图11 1-4:双黄连口服液样品14.13.12.11；5:连翘苷对照品Fig 11 1-4:Shuanghuanglian oral liquid sample14.13.12.11；5:Phillyrin reference substance

图12 1-4:双黄连口服液样品18.17.16.15；5:连翘苷对照品Fig 12 1-4:Shuanghuanglian oral liquid sample18.17.16.15；5:Phillyrin reference substance

2.2 含量测定结果

2.2.1 黄芩苷、绿原酸含量测定结果 《中国兽药典》二部规定：双黄连口服液每1 mL含黄芩以黄芩苷计不得少于10.0 mg[1]。

双黄连口服液黄芩苷含量测定结果见表2，样品1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、18中的黄芩苷含量均高于10.0 mg/mL，而样品8、9、10、14、15、16、17中的黄芩苷含量均低于10.0 mg/mL。

表2 双黄连口服液黄芩苷含量测定结果Tab 2 Determination of Baicalin in Shuanghuanglianoral liquid

《中国兽药典》二部规定：双黄连口服液每1 mL含金银花以绿原酸计不得少0.60 mg[1]。

双黄连口服液绿原酸含量测定结果见表3，样品1、2、3、4、6、11中的绿原酸含量均高于0.60 mg/mL，而样品5、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18中的绿原酸含量均低于0.60 mg/mL。

表3 双黄连口服液绿原酸含量测定结果Tab 3 Determination of Chlorogenic Acid inShuanghuanglian oral liquid

2.2.2 连翘苷含量测定结果 《中国兽药典》二部规定：双黄连口服液每1 mL含连翘以连翘苷计不得少于0.30 mg[1]。

双黄连口服液连翘苷含量测定结果见表4，样品1、2、3、4、6、7、11中的连翘苷含量高于0.30 mg/mL，而样品5、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18中的连翘苷含量低于0.30 mg/mL.

表4 双黄连口服液连翘苷含量测定结果Tab 4 Determination of Phillyrin in Shuanghuanglianoral liquid

计算双黄连口服液黄芩苷、绿原酸及连翘苷含量与含量限度的百分比见表5，黄芩苷含量与含量限度的百分比≥150%比例为22.22%、≤100%比例为38.89%。黄芩苷含量与含量限度的百分比最高为439.61%，而最低的为0.17%，相差很大。绿原酸含量与含量限度的百分比≥150%比例为16.67%、≤100%比例为66.67%。绿原酸含量与含量限度百分比最高为231.48%，而最低的为0.02%，相差较大。连翘苷含量与含量限度的百分比≥150%比例为38.89%、≤100%比例为61.11%，连翘苷含量与含量限度的百分比最高为341.87%，而最低的为0.46%，相差较大。

表5 双黄连口服液黄芩苷、绿原酸及连翘苷含量与含量限度的百分比Tab 5 Content and limit of Baicalin, chlorogenicacid and Phillyrin in Shuanghuanglian oral liquid

3 讨 论

在双黄连口服液中，黄芩苷含量范围为0.17%～439.61%、绿原酸含量范围为0.02%～231.48%、连翘苷含量范围为0.46%-341.87%，黄芩苷含量差别尤为突出。绿原酸、连翘苷含量与含量限度的百分比<100%比例分别为为66.67%、61.11%，绿原酸含量不合格是造成双黄连口服液质量问题的主要因素。各厂家药材产地、来源不同对双黄连口服液主要成分含量差异有很大影响。黄芩中黄芩苷含量一般在范围7.95%～32.5%[9-10]，但大多在14. 1% ～32. 5%[11]，一些道地药材中黄芩苷的含量略低于药典中的9%；金银花中绿原酸含量一般在范围1.5%～4.60%[12-14]；连翘中连翘苷含量一般在0.15%～0.90%[15-16]，一般青翘中的连翘苷含量高于老翘。因此在选用药材时，各厂家应严格控制药材质量，不能只局限于道地药材，应从供给稳定性和质量稳定性选择优质的药材。在生产质量控制时，应以临床疗效为导向，确定药材来源，遵循“药材好，药才好”原理，从中药材源头全过程质量控制。

中药不同于化学药，不仅其成分复杂，生产工艺也较难控制，并容易出现漏洞。各厂家生产工艺有所不同，也会造成制剂主要成分含量存在差异。因此各厂家不仅要加强生产过程监管，在中药制剂中更应严格控制好工艺环节操作。从药材的提取、萃取、干燥、混合制剂等过程中都会影响产品最终质量。中药制剂不是质量标准规定出来的，也不是按照质量标准检验出来的，而是生产出来的。生产工艺作为中药制剂成为最终产品的一道工序, 对其质量有着决定性的作用。基于“质量源于设计”理念，优化建立双黄连口服液的生产工艺，并对生产工艺过程中的各个环节进行调控,确保中药制剂质量控制稳定性和有效成分的均一性，提升产品市场竞争力。

黄芩苷是一种相对不稳定的化合物，遇光、热易分解变化[10]；绿原酸是一种不稳定的化合物，在室温下或遇光易分解变化，尤其是在溶液状态下稳定性更差。双黄连口服液在保存过程中绿原酸含量下降明显[17],导致尚处于有效期内的产品经常出现质量不合格的问题。氧化强度和酸碱度对连翘苷稳定性影响较大[15]。因此严格控制双黄连口服液的pH值，建议用棕色瓶保存生产后的双黄连口服液，良好保存和使用，防止产品质量下降。

4 建 议

在黄芩苷的薄层鉴别中，兽药典要求双黄连口服液含量不低于10.0 mg/mL[1]，但薄层鉴别中黄芩苷对照品浓度为0.1 mg/mL，结果中样品斑点明显大于对照品斑点，且对照品斑点较淡，建议薄层鉴别黄芩苷对照品浓度应为1.0 mg/mL。建议展开剂用36%的醋酸，能使黄芩苷与绿原酸斑点良好的分离，方便鉴别。展开剂展开时，温度不宜过高，不利于样品中黄芩苷与绿原酸分离。制备黄芩苷标品溶液时，因其不易溶解，本试验采用超声的方法使其较快溶于甲醇。

pH值是影响绿原酸含量的敏感因素[17]，pH值越大，绿原酸含量下降越快。因此在生产过程中严格控制pH值，防止绿原酸含量下降。建议将双黄连口服液的pH值范围适当降低。

2015版《中国兽药典》(二部)未规定含量上限，黄芩苷含量范围为0.17%～439.61%、绿原酸含量范围为0.02%～439.61%、连翘苷含量范围为0.46%～341.87%，双黄连口服液主要成分的含量存在较大的差异，黄芩苷尤为突出，临床实际给药量会影响临床疗效。这一结果提示临床，主要成分含量差异可能会造成各产品临床疗效存在显著性差异，应选用质量稳定、信誉度高的厂家生产的药品。因此，建议药典质量标准规定含量上限，以此进一步完善和提高质量标准，同时加强质量标准的研究和控制。