ATP1通过调节氧化应激促进白念珠菌逃逸巨噬细胞杀伤的研究

吕妍 张艳丽 张展鹏 赵亚婧 张艺山 李水秀 张宏

暨南大学附属第一医院皮肤科 暨南大学附属第一医院真菌病研究所，广州510632

白念珠菌是人类正常菌群，也是致死性真菌感染重要病原体，侵袭性白念珠菌感染即使接受抗真菌药物治疗，病死率仍接近40%［1-2］。是否能够适应宿主微环境是白念珠菌能否存活并产生致病性的关键。在感染过程中，白念珠菌会遇到宿主各种环境压力，如固有免疫细胞（巨噬细胞、树突细胞或中性粒细胞等）爆发性产生活性氧［如过氧化氢（H2O2）、羟自由基、超氧化物离子］，专门诱导氧化应激反应以杀灭入侵的菌体［3］。为此，白念珠菌进化出多种快速适应机制以有效应对宿主免疫细胞内氧化应激等反应，从而逃逸宿主杀灭。

线粒体复合物V（F1Fo-ATP 合酶）是线粒体氧化磷酸化过程的终端酶和关键酶。研究显示，F1Fo-ATP 合酶在沙门菌对抗吞噬细胞的杀伤中起促进作用［4］。前期我们已报道F1Fo-ATP 合酶α 亚基编码基因ATP1 是白念珠菌致病的关键基因，其缺失后白念珠菌对小鼠完全不具致死性［5］。那么，ATP1是否会影响菌体与宿主相互作用而致病呢？宿主吞噬细胞是系统性真菌感染的第一道中心屏障［6-7］，巨噬细胞是最重要的吞噬细胞之一［8］，而且组织中巨噬细胞又是抗真菌的关键效应细胞［7］。因此，我们拟以前期发现为基础，探索ATP1促进白念珠菌逃逸巨噬细胞杀伤以及氧化应激的机制，为进一步确认ATP1编码的蛋白Atp1p是否为药物新靶点提供扎实的基础。

材料与方法

一、材料

（一）菌株、细胞株、实验动物

白念珠菌亲本株SC5314 由普林斯顿大学Amanda M.Gillum教授惠赠；ATP1缺失株由课题组前期首先构建［5］，与亲本株相比，ATP1缺失株缺少ATP1基因，且毒力因子等表型降低，氧化磷酸化功能受抑制。实验菌株保存于-80 ℃甘油中，实验前将受试菌株连续2 次转种于酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）固体培养基中30 ℃培养，以保证菌株的活力和纯度。小鼠巨噬细胞RAW264.7（ATCC）产自上海盖宁生物科技有限公司。45 只SPF 级健康纯系雌性BALB/c 小鼠（动物质量合格证编号44002100017582），5 ～6 周龄，体重18 ～22 g，来自广东省实验动物中心，分为3 组，分笼饲养（每笼3 只），所有动物均于暨南大学医学院中心实验室动物室（动物实验许可证号20180824-06）在20 ℃～24 ℃、光/暗周期12 h/12 h的环境中饲养。

（二）主要试剂和仪器

酵母提取粉、蛋白胨、琼脂粉（美国BD 公司），RAW264.7 细胞专用培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司），乳酸脱氢酶（LDH）实验试剂盒（英国Abcam 公司），2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFHDA，美国Sigma 公司），SYBR primer Ex Taq 扩增体系（日本Takara公司），细胞计数仪（美国Amersham公司），实时荧光定量PCR 仪（美国Perkin Elmer 公司），多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司），流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司），NanoDrop 2000c分光光度计（美国Thermo Scientific公司）。

二、方法

（一）白念珠菌体内和体外细胞活性测定

1.体外细胞活性：收集对数生长期白念珠菌液，用灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次。用YPD液体培养基重悬菌体并调整至1.0×106细胞/ml，于30 ℃、150 r/min振摇培养。于第1、2、3、4、5天吸取菌液，连续10倍倍比稀释5个浓度梯度，吸取各浓度菌液100 μl点样至YPD固体培养基上，晾干，于30 ℃静置培养48 h，计数菌落数量［9］。实验重复3次。

2. 体内细胞活性：收集对数生长期白念珠菌液，生理氯化钠溶液洗涤菌体3 次，并调整亲本株和ATP1 缺 失 株 分 别 至1.0 × 106细 胞/ml 和1.0 ×107细胞/ml。将小鼠随机分为亲本株组、ATP1缺失组和阴性对照组，每组3只，按照分组分别将菌液尾静脉注射，亲本株组和ATP1 缺失组小鼠每只分别接种亲本株菌液0.1 ml（1.0×105细胞）和ATP1缺失株菌液0.1 ml（1.0×106细胞），阴性对照组注射生理氯化钠溶液0.1 ml。分别于感染后第1、2、3、4、5天取出小鼠的肾，称重并研磨，10 倍系列稀释后取0.1 ml接种于YPD固体培养基上，30 ℃培养，48 h后计数菌落数量［10］。实验重复3次。

（二）菌体与巨噬细胞相互作用实验

1.白念珠菌存活率实验：将小鼠巨噬细胞RAW264.7 传代1 d 后收集，调整细胞为1.0 ×105个/ml 加入96 孔板，每孔100 μl ，置培养箱过夜。向含有巨噬细胞的96孔板中每孔分别加入白念珠菌亲本株菌液或ATP1 缺失株菌液100 μl［感染复数（MOI）5∶1］，置于培养箱37 ℃、5%CO2环境中培养24 h，吹打混匀后吸取上述菌液倍比稀释后接种于YPD 固体培养基上，30 ℃培养48 h，计算白念珠菌单菌落数。白念珠菌存活率=含巨噬细胞孔的白念珠菌菌落数/不含巨噬细胞孔的白念珠菌菌落数×100%［11］。实验重复3次。

2.巨噬细胞损伤率实验：巨噬细胞处理同上，分为实验组和阳性对照组，实验组中分别加入白念珠菌亲本株菌液或ATP1 缺失株菌液100 μl（MOI 5∶1），置于培养箱（37 ℃、5%CO2）培养4 h；阳性对照组加入15 μl 裂解液，置于培养箱37 ℃、5%CO2环境中培养45 min。处理完成后，将上清液分别转至新的96 孔板中，加入等量细胞裂解液CytoTox96试剂，避光30 min。加终止液，检测A490 值，计算LDH释放百分比［11］。实验重复3次。

（三）H2O2对菌体细胞活性的影响

1.点板实验：收集对数生长期白念珠菌菌液，PBS重悬菌体并调整白念珠菌至1.0×106细胞/ml，连续10 倍倍比稀释5 个浓度梯度。吸取各浓度菌液5 μl点样至含H2O2（6 mmol/l）的YPD固体培养基上，将平板晾干，于30 ℃静置培养48 h，观察菌落生成状态并拍照［12］。实验重复3次。

2.H2O2对菌体的杀死率：收集对数生长期白念珠菌液，用YPD 液体培养基重悬并调整新鲜白念珠菌菌体至1.0 × 106细胞/ml，分为实验组和对照组，将100 ml 实验组白念珠菌液和68 μl 30%H2O2溶液（终浓度为6 mmol/L）加入250 ml 的玻璃锥形瓶里，对照组仅将白念珠菌液加入玻璃锥形瓶中，于30 ℃、150 r/min 振摇培养6、12、24 h 后吸取菌液，连续10 倍倍比稀释5 个浓度梯度，吸取各浓度菌液100 μl 点样至YPD 固体培养基上，晾干，于30 ℃静置培养48 h，计数菌落数量，H2O2对菌体的杀死率=（1-含H2O2的白念珠菌菌落数/不含H2O2的白念珠菌菌落数）×100%［12］。实验重复3次。

（四）白念珠菌细胞内活性氧水平测定

采用DCFH-DA 染色测定。巨噬细胞处理同上，向含有巨噬细胞的96 孔板中分别加入白念珠菌亲本株菌液或ATP1 缺失株菌液100 μl（MOI 5∶1），置于培养箱（37 ℃、5% CO2）中培养1 h。收集菌体，用PBS洗涤菌体3次。采用流式细胞仪测定荧光值（激发光：595 nm；发射光：488 nm）。

此外，用YPD 液体培养基调整白念珠菌至1.0×107细胞/ml，加入H2O2（终浓度为1.6 mmol/L）后，于30 ℃、150 r/min振摇培养6 h。离心收集菌体，用灭菌PBS洗3次，并用PBS调整至1.0×107细胞/ml。加入DCFH-DA 染色液（终浓度为20 mg/L），37 ℃静止避光培养20 min。离心收集菌体，用PBS 洗涤菌体3次。采用流式细胞仪测定荧光值（激发光：595 nm；发射光：488 nm）［12］。实验重复3次。

（五）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测过氧化氢酶1（CAT1）基因、超氧化物歧化酶4（SOD4）基因和超氧化物歧化酶5（SOD5）基因mRNA水平

收集对数生长期白念珠菌液，用YPD 液体培养基调整至2.0 × 106细胞/ml，加入H2O2（终浓度为1.6 mmol/L）后，于30 ℃，150 r/min 振摇培养6 h。离心收集菌体，参照文献［13］提取白念珠菌RNA。用NanoDrop 2000c 分光光度计测RNA 浓度并用Thermo Scientific 反转录试剂盒进行反转录。以2 μl cDNA 为模板，加入SYBR primer Ex Taq 10 μl，正反向引物各0.5 μl，双蒸水7 μl，RT-qPCR扩增（95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40 个循环）。由系统软件（Bio-Rad）监测并计算Ct值，应用2-△△Ct法计算基因mRNA表达水平［13］。实验重复3次。

（六）统计学方法

采用SPSS13.0 和Graphpad Prism 6.0 软件进行统计分析、绘图。采用重复测量设计的方差分析统计白念珠菌体内外细胞活性；采用重复测量设计的方差分析和Student t检验分析H2O2对菌体细胞活性的影响；采用Student t检验分析菌体与巨噬细胞相互作用；采用双因素方差分析统计实时荧光定量PCR的结果。P ＜0.05为差异有统计学意义。

图1 ATP1对白念珠菌体外和体内细胞活性的影响 1A：在YPD液体培养基中的细胞活性；1B：白念珠菌尾静脉接种小鼠后肾脏载菌量。CFU：菌落形成单位

结 果

一、ATP1 缺失后白念珠菌体外和体内细胞活性降低

对白念珠菌在体外形成菌落数进行重复测量设计方差分析，结果显示，时间效应有统计学意义（F=1 277.80，P=0.021）；时间与处理交互效应也有统计学意义（F=612.81，P=0.030）；菌落数随时间呈线性增长（F=138.46，P ＜0.001），亲本株组和ATP1 缺失组随时间变化趋势不同（F = 90.12，P =0.001）；ATP1缺失组在体外培养第3天菌落数约是亲本株组的10%（F=481.84，P ＜0.001）（图1A）。

对小鼠每个时间点肾脏组织形成菌落数进行统计分析，结果显示，小鼠肾脏组织形成菌落数随时间变化（F=538.10，P=0.032）；亲本株组和ATP1缺失组比较，肾脏组织形成菌落数随时间变化的趋势不同（F=609.41，P=0.030）；亲本株组肾脏组织形成菌落数随时间呈线性增加趋势，但ATP1 缺失组随时间呈线性减少趋势（F=11.79，P=0.026）；两组间肾脏组织形成菌落数不同，ATP1缺失组显著低于亲本株组（F=78.27，P=0.001）（图1B）。

二、ATP1 缺失后白念珠菌与巨噬细胞相互作用减弱

存活率实验结果显示，白念珠菌细胞与小鼠巨噬细胞共培养后，ATP1 缺失组菌体存活率为（62.67 ± 3.51）%，亲本株组为（82.33 ± 2.52）%，两组差异有统计学意义（t=7.88，P=0.001）。损伤率实验显示，与ATP1 缺失组共培养的巨噬细胞LDH释放百分比为（27.80±3.54）%，与亲本株组共培养的巨噬细胞为（87.78±0.17）%，两者差异有统计学意义（t=33.89，P ＜0.001）。

三、ATP1缺失后白念珠菌对H2O2敏感性增强

点板实验结果显示，在YPD 固体培养基中，ATP1 缺失株与亲本株生长无明显差异；在含H2O2的YPD 固体培养基中，亲本株生长与在YPD 中比较无明显差异，而ATP1 缺失株明显受抑制（图2A）。

重复测量设计的方差分析显示，白念珠菌细胞活性在H2O2作用下随时间显著变化（F = 18.85，P=0.02）；时间与处理交互效应无统计学意义（F=7.29，P = 0.07）；白念珠菌细胞活性随时间呈线性减少趋势（F=40.60，P=0.003），ATP1缺失株细胞活性随时间减少趋势比亲本株更明显（F=12.63，P=0.024）；两组间细胞活性不同，ATP1 缺失组显著低于亲本株组（F=3 440.65，P ＜0.001）。另外，采用非配对t检验分别对每个时间点的细胞活性进行分析，发现ATP1 缺失组H2O2的杀菌率均明显高于亲本株组，差异有统计学意义（6 h：t=7.100，P=0.002；12 h：t = 10.830，P = 0.001；24 h：t = 16.400，P=0.001）（图2B）。

四、ATP1缺失株细胞内活性氧水平升高

析因设计的方差分析显示，与巨噬细胞共培养后白念珠菌细胞内活性氧水平高于单独白念珠菌培养（F1，8=32.44，P ＜0.001）；ATP1 缺失组细胞内活性氧水平高于亲本株组（F1，8=7.84，P=0.023）；此外，巨噬细胞对白念珠菌细胞内活性氧水平的影响与ATP1基因有关（F1，8=9.23，P=0.016）。

图2 ATP1 缺失对白念珠菌对H2O2敏感性的影响 2A：白念珠菌在不含或含H2O2的YPD 固体培养基上生长情况 自左向右各孔白念珠菌菌液浓度分别为105、104、103、102、10 个细胞/ml；2B：YPD 液体培养基中H2O2对白念珠菌杀死率随时间变化情况。两组间比较，a：P＜0.01；b：P＜0.001

此外，在通过H2O2建立的模拟巨噬细胞内氧化应激模型中，H2O2组白念珠菌细胞内活性氧水平比未用H2O2组高（F1，8=154.5，P ＜0.001）；ATP1 缺失组也比亲本株组高（F1，8=85.62，P ＜0.001）。此外，H2O2对白念珠菌细胞内活性氧水平的影响与ATP1基因有关（F1，8=82.02，P ＜0.001）。

五、ATP1 缺失株细胞氧化应激和活性氧清除相关基因的mRNA表达水平降低

见表1。析因设计的方差分析显示，H2O2作用于白念珠菌后H2O2酶基因CAT1 mRNA 水平高于未用药组（F1，8= 114.80，P ＜0.001）；ATP1 缺失组CAT1 mRNA 水平低于亲本株（F1，8= 287.10，P ＜0.001）；H2O2对白念珠菌CAT1 mRNA 水平的影响与ATP1 基因有关（F1，8=41.54，P ＜0.001）。此外，H2O2作用于白念珠菌后超氧化物歧化酶基因SOD4和SOD5 mRNA 水平均高于未用药组（F1，8=11.00，P = 0.011；F1，8= 1 033.00，P ＜0.001），ATP1 缺失组均低于亲本株组（F1，8= 12.80，P = 0.008；F1，8=1 398.00，P ＜0.001），H2O2对白念珠菌SOD4 和SOD5 mRNA 水平的影响与ATP1 基因有关（F1，8=12.36，P=0.008；F1，8=1 155.00，P ＜0.001）。

讨 论

前期我们发现，ATP1 缺失后高剂量（1.0×106细胞）白念珠菌对小鼠完全不致死［5］，虽然ATP1缺失株在体外细胞活性比亲本株降低大约10 倍，但其对小鼠不致死的机制不能简单地用ATP1缺失后白念珠菌生长缺陷解释。为此，我们通过尾静脉接种中剂量（1.0×105细胞）亲本株和10 倍于亲本株剂量（1.0×106细胞）的ATP1 缺失株菌体到小鼠体内，发现接种亲本株的小鼠于18 d 时全部死亡，而接种10 倍于该剂量的ATP1 缺失株菌体小鼠90 d时全部存活，而且一般状态、生命体征与接种生理氯化钠溶液组小鼠无明显差异［5］。提示ATP1缺失后白念珠菌对小鼠完全不致死不能完全归因于生长缺陷。为了进一步验证该结论，我们进一步观察中剂量亲本株和10 倍于其剂量的ATP1 缺失株菌体在小鼠体内的细胞活性。结果显示，亲本株组肾脏组织形成菌落数随时间呈线性增加趋势，而ATP1缺失组肾脏组织形成菌落数随时间呈线性减少趋势，甚至在接种第3天时检测不到菌体。提示ATP1缺失后白念珠菌对小鼠完全不致死与其被清除有关。前期病理检测结果显示，ATP1 缺失株对小鼠组织不产生损害，进一步验证了该推论。

表1 ATP1对白念珠菌CAT1和SOD4、SOD5基因mRNA水平的影响（±s）

表1 ATP1对白念珠菌CAT1和SOD4、SOD5基因mRNA水平的影响（±s）

注：CAT1，过氧化氢酶1；SOD4，超氧化物歧化酶4；SOD5，超氧化物歧化酶5

组别n 33 CAT1 H2O2（-）1 0.20±0.02 H2O2（+）2.31±0.23 0.53±0.13 SOD4 H2O2（-）1 1.04±0.18 H2O2（+）8.06±3.57 0.84±0.19亲本株组ATP1缺失组SOD5 H2O2（-）1 0.67±0.06 H2O2（+）7.40±0.31 0.49±0.11

当病原体侵入机体后，以巨噬细胞为代表的吞噬细胞立即响应，识别、吞噬病原体并调动还原型辅酶Ⅱ氧化酶体和线粒体向吞噬泡内释放大量活性氧以实现对病原体的杀灭和清除。那么，ATP1缺失株是否未能逃逸免疫细胞杀伤而被宿主清除？为了验证该假设，我们在体外将菌体与巨噬细胞共培养，进一步检测菌体细胞活性以及巨噬细胞LDH水平，结果显示，ATP1缺失后菌体存活率及其对巨噬细胞损伤均明显降低。说明ATP1在白念珠菌逃逸巨噬细胞杀伤中起促进作用。

严重的氧化应激是真菌病原体吞噬过程中的主要免疫防御反应［3，14］，那么ATP1是否通过介导氧化应激以逃逸巨噬细胞杀伤呢？通过点板实验和测定白念珠菌在模拟巨噬细胞内氧化应激模型下细胞活性，我们发现，ATP1缺失后白念珠菌对H2O2敏感性增强。此外，我们通过化学发光测定白念珠菌在H2O2作用下细胞内活性氧水平，发现ATP1 缺失后白念珠菌清除活性氧能力显著降低。上述结果均提示，ATP1 在白念珠菌中抵抗氧化应激和清除活性氧的功能。

活性氧累积增加不能简单地用ATP1缺失后白念珠菌形态转换缺陷解释。Lopes da Rosa等［15］研究发现，Rtt109缺失后菌株虽然形态转换缺陷，但活性氧累积无差异。在感染过程中，免疫细胞爆发性产生活性氧来杀灭入侵病原体，白念珠菌通过上调吞噬细胞内H2O2酶和活性氧解毒酶——超氧化物歧化酶来对抵抗这种攻击［3］。我们推测，ATP1缺失后菌体抵抗氧化应激和清除活性氧降低的表型极有可能归因于下调H2O2酶和超氧化物歧化酶编码基因。RT-qPCR数据验证了该推测，ATP1缺失后白念珠菌H2O2酶和超氧化物歧化酶基因表达降低。

总之，本研究表明ATP1 缺失后分别通过下调氧化应激和活性氧清除相关基因表达使白念珠菌抵抗氧化应激和清除活性氧能力明显减弱，从而不能逃逸巨噬细胞监督而被宿主清除。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突