一个罕见黏多糖贮积症Ⅲ型家系的诊断及产前诊断

潘丽，苏文，林道彬

珠海市妇幼保健院产前诊断中心1、检验科/遗传所2，广东 珠海 519000

黏多糖贮积症Ⅲ型(mucopolysaccharidosisⅢ，MPSⅢ)又称Sanfilippo综合征，属于常染色体隐性遗传病，是由于硫酸乙酰肝素降解过程中所需的四种不同酶的缺陷所致[1-2]，属于一组溶酶体贮积症。据缺陷酶类型的不同，可以把MPSⅢ分为ⅢA、ⅢB、ⅢC和ⅢD四种亚型。ⅢA型是由于乙酰肝素N-硫酸酯酶(heparan N-sulfatase，SGSH)缺陷，使硫酸乙酰肝素不能降解而在细胞内积聚，从而导致进行性多系统损害。4种亚型的患者临床表现非常相似，主要为进行性的智力减退。该病临床罕见，在国外新生儿中的发病率为1/70 000，而国内1998年至今报道黏多糖贮积症Ⅲ型产前诊断的文献仅一篇[3]。基因诊断和产前诊断，是目前预防并阻断该病遗传的有效方法。近年来，全外显子测序(whole exome sequencing，WES)技术因为具有高通量、高准确性，还具有高速度等特点，已经被越来越多的临床医生接受，并且应用于临床诊断[4]。本研究应用全外显子测序技术对一个罕见MPSⅢ型家系进行突变分析，明确了家系的致病原因，并为该家系进行了详细的遗传咨询及产前诊断，现报道如下：

1资料与方法

1.1 一般资料 孕妇，女，38岁，瑶族，因“停经16+周，不良生育史，高龄”于2019年7月就诊于珠海市妇幼保健院产前诊断中心。既往体健，G4P2A1，2007年足月顺产一女，体健。2013年足月顺产一男(该患儿为先证者)，现年6岁，出生时无特殊，2岁以后出现进行性加重的智力低下，听力下降，语言发育落后，只能发单音，头部狭长。夫妻双方临床表型正常，否认近亲结婚，否认家族遗传病史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 孕妇及家属知情同意，抽取患儿及其父母的外周静脉血各5 mL，EDTA抗凝，用基因组提取试剂盒(美国Omega公司)提取外周血DNA，-20℃保存。胎儿羊水标本10 mL，基因组提取试剂盒提取羊水DNA，-20℃保存。

1.2.2 羊膜腔穿刺术 孕妇及家属知情同意，孕19周选择羊膜腔穿刺术。术前再次行B超检查，明确胎儿双顶径、羊水池深度等情况。采用日本进口22G150 mm PTC穿刺针，B超引导下进针，抽取羊水10 mL送细胞培养染色体核型分析、染色体微阵列分析及全外显子测序。

1.2.3 染色体核型分析 外周血或羊水细胞体外培养，经过收获、制片、消化、G显带染色以及扫描后，行染色体核型分析。

1.2.4 染色体微阵列分析 使用美国Affymetrix公司的全基因组CytoScan 750K芯片，严格按照实验操作流程，进行基因组DNA的消化、连接、PCR扩增、纯化、芯片杂交、洗涤、扫描，最后进行数据分析。数据分析过程参考实验室内部数据库及在线公共数据库。

1.2.5 全外显子测序 送深圳华大临床检验中心，进行全外显子测序。首先利用Covaris LE220超声波仪(Massachusetts，USA)将基因组DNA打断并制备文库，然后通过芯片对目标基因外显子及临近剪切区的DNA进行捕获和富集，最后使用高通量测序平台BGISEQ-500进行变异检测，并依据ACMG指南判断变异的致病性[5-8]。参考dbscSNV(1.1)数据库、EPS6500(V2)数据库、ExAC(r0.3.1)数据库及千人基因组数据库对数据进行信息学分析，参考基因突变相关数据库GnomAD(r2.0.1)和Clinvar进一步对可疑致病位点进行确认，找出致病位点。

1.2.6 Sanger测序验证 根据全外显子测序的结果，采用Sanger测序对先证者及其父母进行验证，明确致病位点，并对胎儿进行产前诊断。

1.2.7 遗传咨询 由经过专业培训的临床遗传咨询医师进行所有项目的检测前、检测后以及患儿预后、治疗的详细遗传咨询及临床评估。

2结果

2.1 患儿及其父母全外显子测序结果 患儿全外显子测序，目标区域平均测序深度为144.03倍，目标区域覆盖度达99.89%，其中测序深度达到20倍以上的区域占全部芯片目标捕获区域的98.00%，芯片对目标区域覆盖良好。通过对测序数据进行过滤，筛选出了多个突变位点，详见表l。通过数据分析，发现了SGSH基因的NM_000199.3:c.703G＞A(p.Asp235Asn)突变已有致病性相关报道[9-10]，且ESP数据库、千人数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现该突变。综合分析患儿临床表型、突变位点，以及其父母双方的全外显子测序结果，最终确定该突变为该家系的致病突变。

表1 患儿全外显子测序检测相关突变结果及突变来源

2.2 患儿及胎儿Sanger测序结果 患儿检出SGSH基因的NM_000199.3:c.703G＞A(p.Asp235Asn)纯合突变，其父母均为该突变的杂合携带者。明确该家系致病位点后，抽取羊水对胎儿进行Sanger测序，结果提示胎儿为该突变的杂合携带者。先证者及胎儿的测序结果对比见图1。

图1 SGSH基因Sanger测序结果

2.3 胎儿染色体核型分析及染色体微阵列分析结果 因孕妇38岁，为高龄孕妇，故详细遗传咨询后，在知情同意的前提下，除进行胎儿SGSH基因检测外，同时对胎儿进行了染色体核型分析及染色体微阵列分析。胎儿染色体核型分析结果为46,XN，染色体微阵列分析结果未发现已知具有明确临床致病意义的拷贝数变异。

3 讨论

3.1 全外显子测序明确家系致病原因 2011年，WORTHEY等[11]第一次将全外显子测序成功应用于一名婴儿，对其进行了罕见炎性肠病突变位点的临床诊断，相关检测结论对该名婴儿的后期治疗产生了非常积极的影响。目前全外显子测序在二代测序技术中拥有非常大的优势：(1)与全基因组测序相比，全外显子测序在基因组中所占比例约为2%[12]，所占比例很小，故具有更好的目标区域覆盖率；(2)因其所需分析的数据较少，故数据分析更简便，也具有更低的价格；(3)全外显子测序技术还具有高通量、高准确性以及高速度等特点。正因为有这些优势，全外显子测序技术已被越来越多的临床医生接受，并应用于临床诊断[4]。尤其在2016年，一项涉及54个国家1 000个家庭的研究表明，对非特异性或异构表型的疾病而言，全外显子测序是一种有效的诊断工具[13]。综合国内外文献，多数研究人员认为，全外显子测序对未确诊疾病的诊断率比经典遗传诊断方法更高。在国外，甚至已经有研究人员呼吁将全外显子测序作为未确诊疾病的一线诊断工具，以便能给患者带来更好的医疗护理，但目前还没有形成相关的临床共识，也没有相关的临床指南出台。本研究中，患儿表现为进行性加重的智力低下，听力下降，语言发育落后，只能发单音，头部狭长，这些临床表型均为非特异性，且该患儿也未进行相关检测，诊断不明。此外，患儿已有一个表型正常的同胞姐姐，家族中没有与患儿相似的病例。在没有特异性的临床表型，也没有家族史的情况下，临床很难对其明确诊断。患儿母亲已经孕16+周，要对胎儿进行诊断，迫切需要考虑到时间效益和经济效益，需要寻求一次性、全面性的遗传学检测方法。结合国内外文献资料，临床认为该患儿符合全外显子测序的应用指征[13-14]。在经过详细遗传咨询、患儿父母知情同意的前提下，应用全外显子测序技术对该家系进行突变分析。笔者发现并筛选出了多个变异位点，通过查阅相关数据库及文献，综合患儿临床表型及其父母全外显子测序结果分析，明确了患儿致病原因为MPSⅢA相关SGSH基因NM_000199.3:c.703G＞A(p.Asp235Asn)纯合突变导致SGSH缺陷而致病，同时明确患儿父母为该位点杂合突变携带者。此外，用Sanger测序对全外显子测序结果进行了验证。最终对患儿母亲行羊膜腔穿刺术抽取羊水，对胎儿进行MPSⅢA相关的SGSH基因同一位点的突变检测，明确胎儿为该位点的杂合突变携带，有效避免了该家系再次出生MPSⅢA患儿。患儿母亲年龄为38岁，属于高龄孕妇，为避免染色体病患儿出生，在进行胎儿MPSⅢA相关的SGSH基因突变检测的同时，也同时进行了染色体核型分析及染色体微阵列分析。

3.2 MPSⅢA的预后及治疗 2018年黏多糖贮积症被列入我国国家卫生健康委员会、科技部等五部门联合发布的《第一批罕见病》中，该病分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ型等7种，国内报道较多的是Ⅰ型和Ⅱ型[15-16]。MPSⅢ型在国内尤为罕见,发病率尚无报道。MPSⅢA型属于Ⅲ型中最严重的一种类型，是由于SGSH缺陷，使硫酸乙酰肝素不能降解而在细胞内积聚，从而导致进行性多系统损害，特点为发病早、生存期短、病情恶化快。临床主要表现为中枢神经系统严重退化，但只有轻微的躯体障碍，通常在2～6岁之间开始表现出临床症状，大多数患者在6～10岁时会出现严重的神经系统退化。本研究明确了患儿的致病突变位点，回顾分析其临床表型时，发现与MPSⅢA的临床表型是相符的。基因水平病因的明确为正确评估患儿将来的临床预后起到了重要作用。

对于MPS患儿的治疗，目前缺乏彻底根治的方法，仅仅是对症治疗。最有希望的治疗方法是特异性的酶替代治疗及基因治疗，两者可改善患儿的临床表现以及生存情况，且目前已有酶替代治疗进入临床阶段[17]。但MPSⅢ型是一个困难的挑战，因为与其他型别的MPS不同，MPSⅢ型患者主要表现为严重的神经退行性改变，故该型的治疗中酶作用的主要目标是中枢神经系统。因为血脑屏障存在，即使血液中的酶浓度很高，也不能有效的穿过血脑屏障到达中枢神经系统起作用。目前，国内外还没有批准的MPSⅢ酶替代治疗方法，但国外已有研究团队开发了针对MPSⅢ的腺相关病毒载体介导的基因治疗策略[17]，相信在不久的将来MPSⅢ患儿也能接受有效的基因治疗。

综上所述，SGSH基因c.703G＞A(p.Asp235Asn)是该黏多糖贮积症Ⅲ型家系的致病原因，可以根据该致病突变对家系中的携带者进行产前诊断，避免再次出生黏多糖贮积症Ⅲ型患儿。且根据检测结果，能对家系中已有的MPSⅢA患儿进行准确的临床预后及相应治疗的评估。