贝尔鲫的倍性及染色体核型分析

孙 杰，俞 丽，赵宜双，金 华，高永平，金万昆

(1.天津市换新水产良种场，天津 宁河 301500；2.农业部天津鲤鲫鱼遗传育种中心，天津 宁河 301500；3.天津市淡水鱼类遗传育种企业重点实验室，天津 宁河 301500)

为寻找鲫鱼良种种源，培育出天然、绿色鲫鱼品种，天津市换新水产良种场自2005年开始，先后多次赴内蒙古贝尔湖寻找收集该湖野生鲫鱼资源。2014年9月在当地渔民帮助下，从该湖成功引进野生鲫鱼(Carassiusauratusgibelio)46尾，总体重20.48 kg，尾均重445.21 g。依其产地，将其命名为“贝尔鲫(Carassiusauratusgibelio‘Buir’)”。为进一步了解贝尔鲫的遗传学特性，对其进行了倍性和染色体核型的初步研究，以期为合理保护和开发利用贝尔鲫自然种质资源提供科学依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料

实验鱼是天津市换新水产良种场2014年9月引进的贝尔鲫，经池塘饲养越冬后，于2015年3月21日对28尾贝尔鲫(全长24.0～27.5 cm、体长19.0～23.7 cm、体重222～589 g)进行采血鉴定倍性。确定倍性后，同年5月用三倍体贝尔鲫催产繁殖后获得F1，培育至秋片鱼种。随机对388尾贝尔鲫F1(体重106 g)进行采血确定倍性，并对其中的15尾(体长13.76～14.70 cm，平均14.31 cm；体重87～111 g，平均99.75 g)进行染色体制备，确定染色体数目和核型。

1.2 倍性的观察方法

1.2.1 红细胞玻片的制备及测量 采用尾柄部取血，制成血液玻片，经甲醇固定后，用Giemsa染色15 min，空气干燥后，在Nikon Eclipse E200显微镜15×100油镜下测量红细胞及红细胞核的短径(a)和长径(b)，用公式a×b×π/4计算红细胞的面积及红细胞核的面积，用公式a2×b/1.91计算红细胞核的体积[1]。每尾鱼测定32个红细胞，求出每个个体红细胞的平均值和标准差，用SPSS19.0软件统计分析差异显著性。依据小野里坦[2]和董仕[3]的标准，判断贝尔鲫的倍性。

1.2.2 染色体标本的制备和核型分析 实验前一周将鱼放入室内充氧的水族箱(0.9 m×0.4 m×0.6 m)中暂养，水温控制在(20±1)℃。暂养3 d后参照林义浩的方法[4]，在试验鱼的胸鳍基部注射小牛血清和植物血球凝集素(PHA)，注射剂量为0.5 mL/100 g鱼体重量，植物血球凝集素(PHA)剂量为1 μg/g鱼体重量。12 h后注射秋水仙素，剂量为1 μg/g鱼体重。3 h后杀鱼放血，取头肾，用生理盐水清洗，置于装有生理盐水的培养皿中，用镊子反复撕碎，然后取细胞悬浮液于离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入0.5% KCl低渗液并吹打均匀，室温下低渗40 min，随后1 000 r/min离心5 min收集沉淀，加入新配置的卡诺氏液(冰醋酸∶甲醇=1∶3)固定15 min后，再以1 000 r/min离心5 min，重复固定并离心2次，完成后弃去上清液，加入少量卡诺氏固定液(冰醋酸∶甲醇=1∶1)制成细胞悬液，将其保持一定高度均匀滴在经过预冷的载玻片上，制成染色体标本，空气干燥后用Giemsa液染色30 min，冲洗后自然晾干，镜检。

染色体的分类及测量：将制备好的染色体标本放于Nikon Eclipse E200双筒显微镜下观察，选取分散良好，形态清晰的分裂相，用Discovery C15显微摄像头，通过ISCapture软件在计算机上拍照并计数每个中期分裂相的染色体数，统计染色体众数。从中选取5个完整、形态清晰的分裂相，用A4纸打印放大后进行染色体组型分析。计算每对染色体的臂比和着丝点指数。染色体分类、分组的标准参照Levan等[5]提出的标准，臂比=长臂/短臂。按Matthey[6]的方法进行染色体臂数(NF)的统计，中部和亚中部着丝粒染色体的臂数计为2，亚端部和端部着丝粒染色体臂数计为1。

2 结果

2.1 红细胞测量结果与倍性

2.1.1 贝尔鲫的倍性 通过血细胞测定，在28尾鱼中，红细胞长径在10.73～13.66 μm，平均为(12.21±1.46)μm的有3尾，红细胞长径在14.69～16.14 μm，平均为(15.23±0.46)μm的有25尾，可以作为判别二倍体和三倍体贝尔鲫的方法(见封三图1)。由表1可见，三倍体贝尔鲫各项数值都高于二倍体。三倍体红细胞长径、短径、面积、体积分别为二倍体的1.25，1.07，1.33，1.42倍，三倍体红细胞核长径、短径、面积、体积分别为二倍体的1.20，1.03，1.23，1.25倍。

表1 三倍体与二倍体贝尔鲫红细胞及红细胞的测量值

通过性别鉴别，在28尾中，雌鱼23尾，占82.14%；雄鱼5尾，占17.86%。23尾雌鱼中，二倍体的3尾，体重293～316 g，平均为301.67 g；三倍体的20尾，体重222～589 g，平均为438.9 g。5尾雄鱼，均为三倍体，体重250～352 g，平均为298.8 g。

2.1.2 F1代的倍性 通过对388尾贝尔鲫F1红细胞长径的测量，结果是红细胞长径平均为(17.19±0.43)μm，最小15.64 μm，最大19.03 μm，由此确定为三倍体。

2.2 染色体数及组型

对15尾贝尔鲫头肾组织中的166个中期分裂相进行了计数分析。结果表明，染色体数为156条的有69个细胞，占41.57%；染色体数少于156的有58个细胞，占34.94%，染色体数多于156的有39个细胞，占23.49%；染色体数分布较散，但156条染色体数相对集中，故将贝尔鲫染色体数定为156条，同时还存在一些小染色体。统计结果如表2所示。

表2 贝尔鲫的染色体数目

2.3 贝尔鲫的染色体核型

测量了5个贝尔鲫细胞分裂相的染色体长臂和短臂，分别计算出每条染色体的臂比和着丝点指数，结果见表3。按照Levan[5]标准配成中部着丝粒染色体(m)14对；亚中部着丝粒染色体(sm)16对；亚端部着丝粒染色体(st)9对；端部着丝粒染色体(t)13对。核型公式为3n=156，42 m+48 sm+27 st +39 t，NF=246，见图2(封三)。

表3 贝尔鲫染色体核型数据

3 讨论

据中国鲤科鱼类志(下卷)记载，鲫属(Carassius)在中国有2个种，分别是黑鲫(C.carassius)和鲫(C.auratu)，鲫又分为普通鲫(C.a.auratus)和银鲫(C.a.gibelio)2个亚种，银鲫在中国主要分布于黑龙江和额尔齐斯河等水系[7～10]。在我国不同地区的鲫存在不同的倍性和不同的生殖方式[11]：有的为二倍体，以两性型生殖，如野鲫；有的为三倍体，以雌核发育生殖，如方正银鲫、彭泽鲫。2014年我场引进贝尔湖野生鲫鱼，通过测量血细胞和红细胞核的大小来鉴别倍性的方法可知，在28尾贝尔鲫中二倍体有3尾，三倍体有25尾，说明在贝尔湖中栖息着2种倍性的鲫鱼，且在三倍体群体中有雌雄两性个体。沈俊宝等[11-12]报道的在黑龙江不同水系中有2n=100和2n=150两种类型的银鲫，甚至在同一水域也有这两个种群并存的现象。生活在贝尔湖中的鲫鱼与生活在黑龙江水系中的鲫鱼倍性和生殖方式是否存在相同的现象还有待于进一步研究。

关于银鲫染色体数目的报道结果不一致，并且核型和染色体臂数也不同。如国外报道的二倍体为100，三倍体有150和156[13-15]；日本银鲫(Carassiusauratuslangsdorfii)三倍体为156，四倍体为206[16]。国内报道的银鲫染色体数有156和162[17-20]，其中单仕新和蒋一圭(1988)发现银鲫中染色体数为162，且有8～12个小染色体，昝瑞光(1982)报道滇池高背型鲫具有10±个超数染色体。通过对生活在贝尔湖中的三倍体鲫鱼核型分析，可知其染色体数为156，核型公式为3n=42 m+48 sm+27 st+39 t，染色体臂数(NF)为246，也发现有小染色体。此外，银鲫染色体数目的众数比例较低，滇池高背型鲫的标准染色体数为162，众数百分率为45.9%，沈俊宝等[17]报道的银鲫染色体数为156，众数百分率为40.6%。本文对15尾贝尔鲫的166个分裂相计数结果表明，染色体数少于156的占34.94%；染色体数多于156的占23.49%，染色体数为156条的占41.57%，确定贝尔鲫染色体数为156，明显低于众数应占检测细胞数75%以上的常规标准。鉴于银鲫染色体数目变异幅度大和众数百分率低这一特殊性，推测银鲫可能是一种嵌合的非整倍多倍体鱼类，而贝尔鲫与其它类型鲫鱼在遗传上有无差异，还需要通过多种分子遗传标记检测来证明。